1T/GZTPA 团体标准 T/GZTPA0001-2019 茶叶、蔬菜中克百威残留的测定 酶联免疫吸附法 Determinationofcarbofuranresiduesinteasandvegetables— Enzymelinkedimmunosorbentassay 2019-12-12发布 2020-02-01实施 贵州省绿茶品牌发展促进会发布 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0001-2019 I目次 前言..................................................................................................................................................Ⅱ 1范围................................................................................................................................................1 2规范性引用文件...........................................................................................................................1 3原理................................................................................................................................................1 4试剂和材料...................................................................................................................................1 5仪器................................................................................................................................................2 6试样制备与保存...........................................................................................................................2 7试样测定........................................................................................................................................2 8结果计算........................................................................................................................................3 9检测限、准确度和精密度...........................................................................................................4 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0001-2019 II前言 本标准按照GB/T1.1－2009《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则和国 家茶叶标准的相关规定而起草。 本标准由贵州省绿茶品牌发展促进会提出并归口。 本标准主要起草单位：贵州省绿茶品牌发展促进会、贵州勤邦食品安全科学技术有限公司。 本标准主要起草人:谢体波、雷雨田、胡鹏、张凯、陈鑫、杨玉洁。 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0001-2019 1茶叶、蔬菜中克百威残留的测定酶联免疫吸附法 1范围 本标准规定了茶叶、蔬菜中克百威残留量的酶联免疫吸附测定法。 本标准适用于茶叶、蔬菜中克百威残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3原理 采用间接竞争酶联免疫吸附（ELISA）方法，在微孔条上包被偶联抗原，试样中残留的克百威与酶 标板上的偶联抗原竞争克百威抗体，加入酶标记的抗体后，显色剂显色，终止液终止反应。用酶标仪 在450nm处测定吸光度，吸光值与克百威残留量呈负相关，与标准曲线比较，再乘以其对应的稀释倍 数，即可得出克百威残留含量。 4试剂和材料 4.1克百威试剂盒 4.1.196孔板（12条×8孔）包被有克百威偶联抗原。 4.1.2克百威标准溶液（至少有5个倍比稀释浓度水平，外加1个空白）。 4.1.3克百威抗体溶液。 4.1.4过氧化物酶标记物。 4.1.5底物显色溶液A液：过氧化尿素。 4.1.6底物显色溶液B液：四甲基联苯胺。 4.1.7反应终止液：1mol/L硫酸。 4.1.8复溶液（2倍浓缩液）。 4.1.9洗涤液（20倍浓缩液）。 4.1.10十二水合磷酸氢二钠（分析纯） 4.1.11二水合磷酸二氢钠（分析纯） 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0001-2019 24.1.12乙腈（分析纯） 4.2水：GB/T6682规定的一级水。 4.3试样提取液：称取4.40g十二水合磷酸氢二钠和13.68g二水合磷酸二氢钠，加500mL水溶解 混匀。 4.4蔬菜复溶液工作液：用水将2倍的浓缩复溶液按1∶1体积比进行稀释（1份2倍浓缩复溶液＋1 份水），用于蔬菜试样的稀释，复溶液工作液在4℃可保存一个月。 4.5茶叶复溶液工作液：用水将2倍的浓缩复溶液按3∶7体积比进行稀释（3份2倍浓缩复溶液＋7 份水），用于溶解茶叶试样干燥的残留物，复溶液工作液在4℃可保存一个月。 4.6洗涤液工作液：用水将20倍的浓缩洗涤液按1∶19体积比进行稀释（1份20倍浓缩洗涤液＋19 份水），用于酶标板的洗涤，洗涤液工作液在4℃可保存一个月。 5仪器 5.1酶标仪：配备450nm滤光片。 5.2均质器。 5.3天平：感量0.01g。 5.4振荡器。 5.5离心机：转速≥3000r/min。 5.6涡旋仪。 5.7氮气吹干装置。 5.8恒温箱。 5.9微量移液器：单道20μL～200μL、100μL～1000μL可调，多道250μL。 6试样制备与保存 取茶叶、蔬菜样品，剪碎，10000r/min均质1min。制备好的试样，应即刻进行提取和检测。 7试样测定 7.1提取 7.1.1蔬菜试样 称取蔬菜试样1.0g±0.05g至10mL聚苯乙烯离心管中，加5mL试样提取液（4.6），置于振荡 器上振荡5min，3000r/min以上，20～25℃离心5min，取上清液200μL至2mL聚苯乙烯离心管中， 加入600μL蔬菜复溶液工作液，涡动2min，充分混匀，取50μL用于分析。 7.1.2茶叶试样 全国团体标准信息平台 T/GZTPA0001-2019 3称取茶叶试样1g至50mL聚苯乙烯离心管中，加10mL乙腈，涡动1min，3000r/min以上， 20～25℃离心5min，取上层有机相1mL至10mL洁净干燥的玻璃试管中，于20～30℃水浴氮气流下 吹干，取1.0mL茶叶复溶液工作液溶解干燥的残留物，涡动2min，充分混匀，取50μL用于分析。 7.2测定 使用前将试剂盒在20～25℃下放置1～2h。 7.2.1将标准和试样（至少按双平行实验计算）所有数量的孔条插入微孔架，记录标准和试样的位置。 7.2.2加50μL系列标准溶液（4.1.2）或处理好的试样溶液到各自的微孔中。标准和试样至少做两 个平行试验。 7.2.3加克百威抗体溶液（4.1.3）50μL到每一个微孔中，充分混合，于25℃恒温箱中孵育30min。 7.2.4倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250μL洗涤液 工作液充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作两遍以上（或用洗板机洗涤）。 7.2.5加100μL过氧化物酶标记物（4.1.4），25℃恒温箱中孵育30min。 7.2.6倒出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打以保证完全除去孔中的液体。用250μL洗涤液 工作液充入孔中，再次倒掉微孔中的液体，再重复操作两遍以上（或用洗板机洗涤）。 7.2.7加50μL底物显色溶液A液（4.1.5）和50μL底物显色溶液B液（4.1.6），混合并在25℃ 恒温箱避光显色15min。 7.2.8加50μL反应终止液（4.1.7），轻轻振荡混匀，用酶标仪在450nm处测量吸光度值。 8结果计算 用所获得的标准溶液和试样溶液吸光度值与空白溶液吸光度值的比值进行计算，见式（1）： %100 0rBBA (1) 式中： Ar——相对吸光度值，%； B——标准（试样）溶液的吸光度值； B0——空白（浓度为0的标准溶液