SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 2206.12—2014 化妆品微生物检验方法 第12部分：绿脓杆菌PCR法 Determination of microorganism in cosmetics- Part12:PCR method for Pseudomonas aeruginosa 行业标准信息服务平台 2014-04-09发布 2014-11-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 2206.12—2014 前言 SN/T2206《化妆品微生物检验方法》共分为13部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：需氧芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌； 第3部分：肺炎克雷伯氏菌； 第4部分：链球菌； 第5部分：肠球菌； 第6部分：破伤风梭菌； 第7部分：蛋白免疫印迹法检测疯牛病病原； 第8部分：白色念珠菌； 第9部分：胆汁酸耐受革兰氏阴性菌； 第10部分：金黄色葡萄球菌PCR法； 第11部分：金黄色葡萄球菌多重实时荧光PCR法； 第12部分：绿脓杆菌PCR法； 第13部分：嗜麦芽窄食单胞菌。 本部分为SN/T2206的第12部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中华人民共和国山东出人境检验检疫局。 业标准信息服务平台 本部分主要起草人：孙军、赵晗、田国宁、张金玲、宫小明、郝莹、王洪兵、张艺兵、孙涛。 I SN/T 2206.12—2014 化妆品微生物检验方法 第12部分：绿脓杆菌PCR法 1范围 本部分适用于化妆品中绿脓杆菌的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB7918.1化妆品微生物标准检验方法总则 GB7918.4化妆品微生物标准检验方法绿脓杆菌 SN/T1193基因检验实验室技术要求 3术语、定义和缩略语 下列术语、定义和缩略语适用于本文件。 行业标 3.1术语和定义 3.1.1 绿脓杆菌Pseudomonasaeruginosa 准信息服务平台 亦名为铜绿假单胞菌，具荚膜、鞭毛，为无芽孢的革兰氏阴性杆菌，能分解蛋白质，发酵糖类能力较 低，能产生绿脓菌素和荧光素。 3.2缩略语 PCR：聚合酶链式反应，简称PCR（polymerasechainreaction） DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate） Taq酶:TaqDNA聚合酶 4方法提要 化妆品经增菌后，提取基因组DNA，以提取的DNA为模板进行绿脓杆菌外毒素A基因高保守片 段的PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物是否有397bp的特征条带，从而对化妆品中是否污染 绿脓杆菌进行快速检验。 1 SN/T 2206.12—2014 5试剂和材料 5.1SCDLP液体培养基（见A.1)。 5.2DNA提取液：主要成分是SDS、Tris、EDTA。 5.3酚-氯仿。 5.4异丙醇。 5.5 PCR扩增引物及目标片断（见附录B)。 5.6 灭菌双蒸水。 5.7 10XPCR缓冲液（见A.2）。 5.8琼脂糖。 6×上样缓冲液（见A.3）。 5.10 50XTAE缓冲液（见A.4）。 5.111 DNA分子量标记物：DL2000。 5.12 Eppendorf管和PCR反应管。 6仪器设备 6.1恒温培养箱：36℃±1℃ 6.2 PCR仪。 6.3电泳仪。 6.4凝胶分析成像系统。 6.5冷冻离心机：离心力12000g。 6.6可调移液器：5μL、10μL、100μL、1000μL。 7操作步骤 7.1样品增菌 按照GB7918.1方法制备1：10化妆品稀释液，取稀释液10mL加到90mLSCDLP液体培养基 中,置36℃±1℃培养18h~24h。 注：如无SCDLP液体培养基时，可用普通营养肉汤培养基。检验含有防腐剂的化妆品时，在每1000mL普通肉汤 中加人1g卵磷脂、7g吐温80。 7.2模板DNA的提取 取样品增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，尽量吸弃上清：加入 750μLDNA提取液，沸水浴5min，加酚-氯仿（1：1体积比）700uL，振荡混匀，12000r/min离心 5min；吸取上清至对应无菌离心管中，加入等体积氯仿，混匀后12000r/min离心5min；吸取上清至 对应无菌离心管中，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，混匀，12000r/min离心5min；轻轻倒去上清液，倒 试剂盒并按其说明制备模板DNA。 2