SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 1632.3—2013 代替SN/T1632.32005 出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属） 检验方法第3部分：荧光PCR方法 Determination of Enterobacter sakazakii(Cronobacter spp.)from dehydrated powdered milk for export-Part 3: Real-time PCR method 行业标准信息服务平台 2013-11-06发布 2014-06-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 1632.3—2013 前言 SN/T1632《出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法》共分为3个部分： 第1部分：分离与计数； 第2部分：PCR方法； 第3部分：荧光PCR方法。 本部分为SN/T1632的第3部分。 本部分依照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本部分代替SN/T1632.3一2005《奶粉中崎肠杆菌检验方法第3部分：荧光PCR方法》。 本部分与SN/T1632.3一2005相比，除编辑性修改外，主要技术变化如下： 修改了标准的中英文名称； 修改了引物和探针； 删除了定义、术语和缩略语； 增加了克罗诺杆菌属内种的分型鉴别方法的资料性附录。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民共 和国天津出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：赵贵明、王、吕敬章、陈颖、杨海荣、赵勇胜、高旗利、张霞、刘培。 本部分所代替标准的历次版本发布情况为： 行业标准信息服务平台 SN/T1632.3—2005。 I SN/T1632.3—2013 出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属） 检验方法第3部分：荧光PCR方法 1范围 SN/T1632的本部分规定了奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）的荧光PCR检测方法。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1632.2一2013出口奶粉中阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）检验方法第2部分：PCR方法 3测定方法 3.1方法提要 奶粉经增菌后，取增菌液1mL加到1.5mL无菌离心管中，以8000r/min的转速离心5min,轻轻 倒去上清液，倒置于吸水纸上，吸十液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；加人50uLDNA提取液 （使用前室温解冻并充分混匀，快速吸取），混匀后沸水浴5min，以12000r/min的转速离心5min，取 上清液作为模板进行荧光PCR扩增.观察荧光PCR仪的实时曲线，从而对奶粉中的阪崎肠杆菌（克罗 诺杆菌属）进行快速检测。 3.2试剂和材料 服务平台 见SN/T1632.1。除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，水为灭菌双蒸水 3.2.1引物： 5'-GGCGAGCGGCGAATATTAT -3' 5'-CGGGTTTTCCCAGTTGAGATC-3' 3.2.2探针： 5'-FAM-CACCAGTTTTCGGTGCGCCAGC-BHQ-3" 3.2.3 Ex Taq DNA 聚合酶。 3.2.4dNTPs:dATP,dTTP,dCTP,dGTP。 3.2.5 DNA提取试剂：0.1%Chelex100（螯合树脂）水溶液。 3.2.610XPCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.4）,200mmol/L氯化钾，15mmol/L氯化镁。 3.2.7 FastSartUniversal Probe Master(2X)。 3.2.8 阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）质控菌株：ATCC29544，或等效菌株。 3.2.9 仪器和设备。 3.2.10 荧光PCR仪。 1 SN/T 1632.3—2013 3.2.11 离心机：20000r/min。 3.2.12移液器：10μL、100μL、200μL、1000μL。 3.2.13水浴锅。 3.3操作步骤（流程见附录A） 3.3.1前增菌和增菌 取检样100g加入已预热至45℃装有900mL灭菌水的锥形瓶中，振摇使样品充分溶解，36℃士 1℃培养18h～22h。移取1mL转种于10mL改良月桂基硫酸盐胰蛋白陈肉汤中（MLST，见 SN/T 1632.2—2013中 A,1),36 ℃±1℃培养18 h~22h。 3.3.2模板DNA准备 每瓶培养的MLST分别取1mL加到1.5mL无菌离心管中，8000r/min离心5min，轻轻倒去上 清液，倒置于吸水纸上，吸干液体，不同样品应在吸水纸不同地方吸干；加人50μLDNA提取液（使用前 （如不能及时检验，可将上清液于一20℃保存）。也可使用其他经验证的DNA提取方法。 3.3.3荧光PCR检测 反应体系总体积为25μL，其中含：上游引物和下游引物（10μmol/L）各0.4μL、FastSartUniversal ProbeMaster（2X）12.5μL、探针（10μmol/L）0.2μL、模板DNA2μL，ddHzO补齐至25μL。反应步 骤：反应步骤一，95℃10min；反应步骤二，95℃5s，55℃退火20s，同时收集荧光信号，共进行40个 循环。反应产物可在4℃保存。检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆 崎肠杆菌DNA模板作阳性对照，大肠杆菌DNA模板作阴性对照，空白对照以无菌水作为模板，加样量 行业权 与样品加样量一致。 4结果与报告 于35.0且小于40.0时，重复一次，如果C，值仍小于40.0，且曲线有明显的对数增长期，可报告崎肠杆 菌（克罗诺杆菌属）筛选阳性，否则报告阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）未检出：样本检测不到C值时，报告 阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）未检出。 4.2筛选阳性的样本按SN/T1632.1进行确证，必要时参考附录B方法，进一步区分到种 4.3报告每100g样品中检出或未检出阪崎肠杆菌（克罗诺杆菌属）。 2