ICS 67.050 SN C 53 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5145.9—2019 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第9部分：狐狸成分检测 PCR-试纸条法 Rapid Identification of animal ingredient in export food and feed Part 9 : Detection of Vulpes Ingredient PCR-Lateral flow dipstick method 2019-10-25发布 2020-05-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5145.9—2019 前言 SN/T5145《出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法》分为以下13个部分： 第1部分：猫成分检测PCR-试纸条法； 第2部分：貂成分检测PCR-试纸条法； 第3部分：鹿成分检测PCR-试纸条法； 第4部分：骆驼成分检测PCR-试纸条法； 第5部分：狗成分检测PCR-试纸条法； 第6部分：牛成分检测PCR-试纸条法； 第7部分：绵羊成分检测 PCR-试纸条法； 第8部分：驴成分检测PCR-试纸条法； 第9部分：狐狸成分检测PCR-试纸条法； 第10部分：鹅成分检测PCR-试纸条法； 第11部分：鸭成分检测PCR-试纸条法； 第12部分：火鸡成分检测PCR-试纸条法； 第13部分：鸽子成分检测PCR-试纸条法； 本部分是SN/T5145的第9部分。 文本为准 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国海关总署提出并归口 本部分起草单位：中华人民共和国天津海关、天津师范大学、中华人民共和国成都海关、北京华大蛋 白质研发中心有限公司、天津科技大学。 本部分主要起草人：郑文杰、李宗梦、林华、张霞、赵良娟、张宏伟、刘伟、王硕、尹长城。 标准信息服务平台 I SN/T5145.9—2019 出口食品及饲料中动物源成分快速检测方法 第9部分：狐狸成分检测PCR-试纸条法 1范围 本部分规定了食品及饲料中狐狸源性成分检测的PCR-试纸条方法。 本部分适用于肉、肉制品及饲料中狐狸源性成分的定性检测。 2规范性引用文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 为 GB/T14699.1饲料采样 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适应于本文件 3.1.1 狐狸Vulpes 属于哺乳纲，食肉目，犬科，狐亚科。本标准中狐狸成分即指狐狸特异性DNA片段。 唯准信息服务平台 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：deoxyribonuleicacid，脱氧核糖核酸。 dNTP：deoxyribonuleosidetriphosphate，脱氧核苷酸三磷酸。 CTAB：cetyltrithylammoniumbromide，十六烷基三甲基溴化铵。 Tris：Tris（Hydroxymethyl)aminomethane，三羟甲基氨基甲烷。 EDTAEthylene diaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸 FITC:Fluorescein5-isothiocyanate异硫氰酸盐。 4方法原理 利用裂解液破碎样本细胞，苯酚-氯仿法抽提基因组DNA，以提取的DNA为模板，采用上游和下游引 物分别经异硫氰酸盐（Fluorescein5-isothiocyanate，FITC）和生物素（Biotin）标记进行PCR扩增，获得两端 分别带有异硫氰酸盐和生物素分子的PCR产物。用含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定 1 SN/T 5145.9—2019 5试剂和材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂，实验用水符合GB/T6682的要求。 5.1狐狸源性成分检测用引物（对）序列及标记物为： 狐狸成分扩增引物详见表1。 表1试验用引物 物种名称 引物序列（5°→3'） 5'端标记物 靶基因 F:5'-CCCTATATCGGAACCGATC-3' 异硫氰酸盐（FITC) 狐狸 CYTB R:5'-GAACTGAAAGGAGAAGTAAAAC-3' 生物素（biotin） 5.2试剂 5.2.1ExTaqHotStartDNA聚合酶(Taq,Termusauaticu)。 5.2.2dNTPs:dATP（deoxyadenosinetriphosphate，脱氧腺苷三磷酸），dTTP（deoxythymidinetriphosphate， 脱氧胸苷三磷酸）、dCTP（deoxyadenosinecytidinetriphosphate，脱氧胞苷三磷酸）、dGTP（deoxyguannosine triphosphate，脱氧鸟苷三磷酸）。 5.2.310XPCR缓冲液:200mmol/LTris-HCl(pH8.4),200mmol/LKCl,20mmol/LMgCl2 5.2.4 三氯甲烷（氯仿）。 5.2.5 5异丙醇。 5.2.6 pH 8.0。 5.2.7 CTAB沉淀液:5g/LCTAB.40mmol/LNaCl,pH8.0。 5.2.8 酚/三氯甲烷/异戊醇溶液：按照Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为25：24：1进行 配制。 5.2.9 三氯甲烷/异戊醇溶液：按照三氯甲烷：异戊醇溶液体积比为24：1进行配制 5.2.10 70%乙醇（V/V) 5.2.11 NaCl溶液(1.2mol/L) 5.2.12 蛋白酶K（20mg/mL）。 5.2.13试纸条：含有金标记的抗异硫氰酸盐的兔多克隆抗体和固定有链亲和素的通用核酸检测试纸 条，可通过采购的原料试剂自行组装（参见附录A）或采用等效的商品化试纸条。 5.2.14展开液：10mmol/LTris、1%BSA，1%（v/v)Tween20以及浓度为0.05mol/L的NaOH；或采 用等效的商品化产品。 仪器设备 6.1 离心机（离心力≥12000g），4℃土1℃。 微量移液器（100L-1000μL，20μL-200μL，2μL-20μL，0.5μL-10μL）。 6.3 PCR 仪。 6.4恒温水浴锅，65℃±1℃。 6.5天平：感量0.01g。 6.6 pH计。 2