ICS 100.99 SN B 16 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5129—2019 苹果属上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和 栗黑水疫霉菌的多重PCR筛查方法 Multiplex PCR screening method of Phytophthora syringae (Berk.)Kleb. Phytophthora hibernalis Carne & Phytophthora cambivora (Petri)Buisman on the Malus 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署发布 SN/T5129—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国天津海关、中国合格评定国家认可中心、中国检验检疫科学研 究院。 本标准起草人：姜一、张莹、苏志明、刘勇、黄国明、吴品珊、罗加凤、魏亚东、廖芳。 业标准信息服务平台 SN/T5129—2019 苹果属上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和 栗黑水疫霉菌的多重PCR筛查方法 1范围 本标准规定了苹果属植物上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的分子生物学检疫鉴定方法 本标准适用于苹果属植物上冬生疫霉菌、丁香疫霉菌和栗黑水疫霉菌的检疫鉴定。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 SN/T2617冬生疫霉病菌检疫鉴定方法 SN/T2756丁香疫霉菌检疫鉴定方法 SN/T2759栗黑水疫霉病菌检疫鉴定方法 3病菌基本信息 中文名：丁香疫霉菌 出版文本为 学名:Phytophthora syringae (Berk.)Kleb. .1909 异名：Phytophthora cactorum subvarsyringae（Berk.）Sarej Nozemia syringae （Berk.） Pethybr 标准信息服务平 英文名:twig blight of lilac,fruit rot 中文名：冬生疫霉菌 学名：Phytophthora hibernalis Carne 英文名：Citrus fruitbrown rot 中文名：栗黑水疫霉菌 学名：Phytophthoracambivora(Petri)Buisman,1927 异名：BlepharosporacambivoraPetri（1917) 英文名：Citrusleaf blight 分类地位：藻菌界（Chromista），卵菌门（Oomycota），腐霉目（Pythiales），腐霉科（Pythiaceae），疫霉 属（Phytophthora）。 三种疫霉可侵染苹果属植物的根、茎、叶和果实，丁香疫霉菌可引起苹果属植物的果腐和颈腐，冬生 疫霉菌可引起苹果属植物的果实褐腐、枝枯和叶枯，栗黑水疫霉可引起苹果属植物的根茎腐烂。病菌可 随进境种苗及果实远距离传播。 4方法原理 依据丁香疫霉菌、冬生疫霉菌和栗黑水疫霉菌的菌落形态学特征及两轮PCR检测结果进行鉴定。 1 SN/T 5129—2019 5仪器及用具 5.1仪器 天平（感量0.001g）、生物安全柜或超净台、高速离心机、往复式振荡器、涡旋振荡器、高压灭菌锅 PCR仪、电泳仪、凝胶成像仪、可调微量加样器、刻度离心管（10mL或20mL）等。 5.2用具 烧杯、三角瓶、镊子、载玻片、盖玻片、量筒、酒精灯、吸管、Parafilm膜或铝箔纸、Eppendorf管 (1.5mL）、接种针、PCR管等。 6 主要试剂及培养基 6.1主要试剂 匹马霉素（Pimaricin）、氨苄青霉素（Ampicillin）、利福平（Rifampicin）、五氯硝基苯（Pentachloroni- trobenzene）、制霉菌素（Nystatin）、恶霉灵（Hymexazol）、CaCO：、琼脂糖，MgCl2、CTAB（十六烷基三甲 基溴化铵）、无水乙醇（Ethanol）、氯仿（Chloroform）、异丙醇（Isopropanol）、异戊醇（Isoamylalcohol）、 蛋白酶K、TAE、琼脂以及PCR试剂氯化钾（KCI)、氯化镁（MgCl）、4种脱氧核糖核酸（dNTPs）、rTaq DNA聚合酶、引物、阳性质粒、溴化乙锭等。 6.2培养基 7检疫鉴定方法 7.1症状检查 仔细检查寄主植物的根、茎、叶、果实等部位，对有枯萎、果腐、根腐、茎腐等症状的植物取样送实验 室做进一步检验。 7.2寄主组织分离培养 可疑症状的根、茎、叶、果实用流水冲洗表面约15min，取根、茎、叶、果实果皮的病健交界处，剪成 5mm×5mm小块，75%酒精消毒30s，无菌水冲洗3次，吸干水分，置于V8或者PDA培养基上分离 培养，在黑暗条件下培养4d，对可疑菌落转接到V8或者PDA培养基上，相关温度及过程参见 SN/T 2756、SN/T 2617SN/T 2759。 7.3DNA提取 收集分离到的病菌菌丝，采用CTAB法提取核酸，具体方法详见附录B。 7.4多重 PCR检测 三种检疫性疫霉的多重PCR检测方法详见附录B。 2