ICS 11.020 SN C 62 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5106—2019 登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法 DNA barcoding identification of Dengue vector-mosquitoes 业标准信息服务平台 2019-09-03发布 2020-03-01实施 中华人民共和国海关总署 发布 SN/T5106—2019 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国福州海关。 本标准起草人：方义亮、张建庆、林醒忠、王宇平、黄恩炯、房长天、吴荣泉。 业标准信息服务平台 SN/T 5106—2019 登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法 1范围 本标准规定了登革热媒介蚊类DNA条形码鉴定方法中DNA提取、基因的扩增及序列的比对分 析、结果判定等。 本标准适用于登革热媒介蚊类白纹伊蚊（Aedesalbopictus）埃及伊蚊（Aedesaegypti）成虫、幼虫、 蛹、残肢不全等标本的DNA条形码鉴定。 2天 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB19489实验室生物安全通用要求 SN/T1876医学媒介生物标本采集、制作及保存规程 SN/T2752.4卫生检疫人员的自我防护规范第4部分：实验室人员 SN/T4278国境口岸医学媒介昆虫DNA条形码鉴定操作规程 WS/T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 3方法原理 出版 利用通用引物对线粒体DNA中的COI基因的特定片段进行扩增，PCR产物克隆或者直接测序 后，得到长度不少于500bp的有效序列，与本标准的标准序列进行比对，从而达到物种快速准确鉴定的 标准信息服 目的。 4鉴定程序 4.1准备 定；PCR防污染措施遵照WS/T230的要求。 配置电泳液TAE（1×TAE):将Tris碱242g，冰醋酸57.1mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0） 100mL，定容至1L，用双蒸水稀释50倍。 4.2标本处理 4.2.1取样 标本样品经过冷冻或乙醚麻醉，死后取成批同种样品的单份标本、珍稀单份标本取对称一侧组织 （如单侧蚊足）置于灭菌的洁净1.5mL离心管留用，如长期不用需放置体积分数为90%以上乙醇 一20℃保存。标本的其它同种个体或者部分针插作为凭证标本 1 SN/T 5106—2019 4.2.2凭证标本制作 将取样后的标本制作成凭证标本，标本的制作按照SN/T1876的要求执行。 4.3DNA制备 将单份样品（成虫、幼虫、）置于已灭菌的洁净1.5mL离心管后用研磨棒研磨，利用商品化昆虫 DNA提取试剂盒进行蚊虫基因组提取（样品为单只蚊的，需去掉头部后（如有吸血的需要去腹部）后再 研磨）；样品为少量对称一侧组织（单侧蚊足）置于已灭菌的洁净1.5mL离心管后用研磨棒研磨，利用 微量组织DAN提取方法（参见附录B）进行蚊虫基因组的制备，制备好的DNA进行浓度及纯度测定 后，保存至一20℃冰箱备用 4.4PCR扩增 4.4.1引物 LCO1490:5-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3 HCO2198:5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3" 4.4.2扩增体系 体为准 性对照；验证PCR反应正常，可设置阳性对照。 Taq PCR Mastermix 25 μL 正反引物（10μM） 模板（50～100μg/μL) 3 μL O"HPP 14 μL 为了提高反应的效果，根据模板的浓度，可以适当增加模板的体积，同时相应减少ddH，O体积，体 系体积不变。 4.4.3扩增条件 第一步:94℃5min； 第二步：95℃30s,46℃30s.72℃40s，35个循环 第三步:72℃7min。 4.5PCR产物检测 4.5.1琼脂糖凝胶的配置 称取1.5g的琼脂粉倒进盛有100mL1×TAE的烧瓶内，置入微波炉加热使其充分溶解直至透亮 即可。 4.5.2电泳 取5uLPCR扩增产物（内含有染料），点样于质量浓度为1.5%的琼脂糖凝胶（含有溴化乙锭），电 泳缓冲液为1XTAE，在恒压80V电泳30min，用凝胶成像系统成像并拍摄。 4.6序列测定 COI序列扩增产物电泳条带在750bp左右（参见附录C），具有目的片段电泳条带的扩增产物可委 2