SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 4849.3—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法 实时荧光PCR法 第3部分：黑加仑 Identification of the ingredients of common small berry fruits in food and juice for export Real-time 行业标准信息服务平台 PCR method—Part 3:Blackcurrant 2017-07-21发布 2018-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4849.3—2017 前言 SN/T4849《出口食品及饮料中常见小浆果成分的检测方法 实时荧光PCR法》系列标准共分为 6个部分： 第1部分：蓝莓； 第2部分：树莓； 一第3部分：黑加仑； 一第4部分：桑甚； 一第5部分：蔓越莓和蓝莓； 第6部分：猕猴桃 本部分为SN/T4849的第3部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国伊犁出人境检验检疫局 本部分主要起草人：陈颖、黄文胜、邓婷婷、吴亚君、杨艳歌、乾义柯、韩建勋、张九凯、刘鸣畅。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4849.3—2017 出口食品及饮料中常见小浆果成分的 检测方法实时荧光PCR法 第3部分：黑加仑 1范围 SN/T4849的本部分规定了出口食品及饮料中黑加仑成分的检测方法实时荧光PCR法 本部分适用于鲜果、冷冻果、蜜饯、鲜榨果汁、果肉型果汁、果干、果酱等以黑加仑为原辅料的初加工 食品及饮料中黑加仑成分的定性检测（清汁及果酒除外）。本部分所规定方法的最低检出限（LOD）为 1%（体积比）。 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T27403一2008实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语、定义和缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 小浆果smallberryfruits 浆果则泛指果实较小、多汁的一类浆果。 3.1.2 黑加仑blackcurrant 服务平台 虎耳草目醋栗科醋栗属植物黑色果实，小浆果，果实近圆形，熟时黑色。拉丁文名：Ribes nigrum L.. 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonuleicacid）。 PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）。 Ct值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 dNTP：脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonuleosidetriphosphate)。 dATP：脱氧腺苷三磷酸（deoxyadenosinetriphosphate）。 dCTP：脱氧胞苷三磷酸（deoxycytidinetriphosphate） 1 SN/T 4849.3—2017 dGTP：脱氧鸟苷三磷酸（deoxyguanosinetriphosphate）。 dTTP：脱氧胸苷三磷酸（deoxythymidinetriphosphate）。 UNG：尿嘧啶N-糖基化酶（uracilN-glycosylase）。 CTAB：十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrithylammoniumbromide）。 Tris：三羟甲基氨基甲烷Tris（Hydroxymethyl)aminomethanel。 EDTA：乙二胺四乙酸(Ethylenediaminetetraaceticacid)。 Taq：水生栖热菌（Thermusaquaticus）。 OD：光度密度（opticaldensity）。 4方法提要 果实样品直接粉碎离心，果汁样品直接离心，提取沉淀DNA，果干、果酱、蜜饯先用蒸馏水清洗再提 取DNA。以黑加仑果实为阳性对照，以其他水果DNA为阴性对照，无菌水作为空白对照。使用特异 性引物探针进行实时荧光PCR扩增，通过实时荧光信号曲线判定是否存在黑加仑成分。 5试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂 均用无DNA酶污染的容器分装。 5.1检测用引物和探针：黑加仑成分扩增引物和探针、内参照（显花植物NADH基因）引物和探针详见 表1。黑加仑引物扩增的靶标序列参见附录A。 表1黑加仑序列引物探针 扩增片 物种名称 引物/探针序列（5'→3) 靶基因 段长度 F:GCTGAAGCACCTACTTTCGAAGTAACA NADH dehydrogenase 内参照 R:AGGAGCCGTGTGAGATGAAAGTCTCA 138 bp subunit B(ndhB)gene P:FAM-TGGAGTGGGAGAGTCAGAGTCGAAAAGAGG-BHQ1 F:TGCCCAAGCAGAGCTTCTG 18S ribosomal RNA(18S 黑加仑 125 bp R:CAACCAGGTAGCATTCCTTTGC rRNA)gene P:FAM-TTGGCTCATGCGACGCCCG-BHQ1 5.2 三氯甲烷（氯仿）。 5.3异丙醇。 5.4CTAB提取缓冲液:20 g/L CTAB,1.4 mol/L NaCl,0.1 mol/L Tris-HCl,0.02 mol/L NazEDTA, pH 8.0. 5.5 CTAB沉淀液:5 g/L CTAB,40 mmol/L NaCl。 5.670%乙醇（体积分数）。 5.7蛋白酶K(20mg/mL)。 5.8实时荧光PCR反应混合液：12.5μL反应体系包括：1U～2U(Unit，酶学单位）的Taq酶、1× PCRbuffer、2.5 mmol/L~4.0 mmol/L 的 Mg²+、0.2 U~1 U的 UNG 酶、0.2 mmol/L 的 d(A,C,G) TPs,0.2 mmol/L~0.4 mmol/L dUTP,400 nmol/LROX染料。