ICS 67.050 CCS X04 中 国 营 养 保 健 食 品 协 会 团体标准 T/CNHFA 002—2022 乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊 （山羊和绵羊）源性成分定性检测方法 实时荧光 PCR法 Qualitative detection of bovine （Bos taurus , Bubalus bubalus and Bos grunniens ）and ovine（Ovis aries and Capra hircus ）derived ingredients in milk and dairy products —Real time PCR method 2022 - 06 - 22发布 2022 - 07 - 01实施 中国营养保健食品协会发布 发布 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 002 —2022 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件 的某些内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由 海普诺凯营养品有限公司 提出。 本文件由 中国营养保健食品协会 归口。 本文件起草单位： 海普诺凯营养品有限公司、中国检验检疫科学研究院、中国检验检疫科学研究院 粤港澳大湾区研究院。 本文件主要起草人： 侯艳梅、杨艳歌、刘鸣畅、吴亚君、吴桐、王云帆、谢奎、王迎春、王洪越、 王丹丹、吴占文、王帅。 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 0 02—2022 1 乳及乳制品中牛（家牛、牦牛和水牛）和羊（山羊和绵羊）源性成 分定性检测方法 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件规定了乳及乳制品 中牛（家牛、牦牛和水牛） 、羊（山羊和绵羊） 源成分以及家牛、牦牛、 水牛、山羊、绵羊单一乳源 成分的实时荧光 PCR定性检测方法 ， 方法的最低检出限为 1%（配料质量比）。 本文件适用于乳及乳制品 中牛（家牛、牦牛和水牛） 、羊（山羊和绵羊） 以及家牛 、牦牛、水牛、 山羊、绵羊源性成分的定性检测，适用的产品 类别包括液态乳（巴氏杀菌乳、 高温杀菌乳、调制乳、 灭 菌乳、发酵乳） 、乳粉（全脂乳粉、脱脂乳粉、部分脱脂乳粉、调制乳粉 、乳清粉 ）、婴幼儿配方乳粉 等。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检验 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 实时荧光 PCR Real -time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个 PCR进程，实现对起始模板的定 量及定性分析。 3.2 Ct值Cycle threshold （Ct） 每个反应管内的荧光信号到达设定的 阈值时所经历的循环数。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 4.1 CTAB：cetyltrithylammonium bromide ，十六烷基三甲基溴化铵。 4.2 cytb：cytochrome b ，线粒体细胞色素 b基因。 4.3 dATP：deoxyadenosine triphosphate ，脱氧腺苷三磷酸。 4.4 dCTP：deoxycytid ine triphosphate ，脱氧胞苷三磷酸。 4.5 dGTP：deoxyguanosine triphosphate ，脱氧鸟苷三磷酸。 4.6 DNA：deoxyribonuleic acid ，脱氧核糖核酸。 4.7 dNTP：deoxyribonuleoside triphosphate ，脱氧核苷酸三磷酸。 4.8 dTTP：deoxythymidine triphosphate ，脱氧胸苷三磷酸。 4.9 EDTA：Ethylene diaminetetraacetic acid ，乙二胺四乙酸。 4.10 GH：Growth Hormone ，生长激素基因。 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 002 —2022 2 4.11 PCR：polymerase chain reaction ，聚合酶链式反应。 4.12 Tris：Tris（Hydroxymethyl ）aminomethane ，三羟甲基氨基甲烷。 4.13 Taq：Thermus aquaticus ，水生栖热菌。 4.14 UNG：uracil N -glycosylase ，尿嘧啶 N-糖基化酶。 5 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全和防止污染， 应由具备资格的工作人员检测， 所有生物安全防护的设施、 设备和安全管理的基本要求按照 GB 19489有关规定执行。 6 方法原理 基于实时荧光 PCR的检测原理， 采用哺乳动物通用 和牛（家牛、牦牛和水牛） 、羊（山羊和绵羊） 、 以及家牛 、牦牛、水牛、山羊、绵羊单一乳源成分的 特异性引物探针 ，对样品中提取的 DNA模板进行 实时荧光 PCR反应。 根据反应结果判定羊乳样品中是否 含有牛（家牛、 牦牛和水牛） 、羊（山羊和绵羊） 、 以及家牛 、牦牛、水牛、山羊、绵羊单一乳源成分 。 7 仪器设备 7.1 实时荧光 PCR仪。 7.2 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计 。 7.3 分析天平：精度 0.1 mg。 7.4 水浴锅。 7.5 离心机：离心力 ≥12000 g。 7.6 微量移液器： 0.5 µ L～10 µ L，10 µ L～100 µ L，20 µ L～200 µ L，100 µ L～1000 µ L。 7.7 涡旋混匀仪 。 7.8 恒温孵育器 。 7.9 pH计。 8 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 的要求。所有试剂均用 无DNA酶污染的容器分装。 8.1 哺乳动物 、牛（家牛、牦牛和水牛） 、羊（山羊和绵羊） 通用引物探针，以及家牛 、牦牛、水牛、 山羊、绵羊成分扩增引物和探针详见表 1。 表1 检测用引物和探针 名称 检测物种 引物序列 （5'--3'） 靶基因 扩增 长度 来源 质控 哺乳动物 F: CTCAGCAGGGTCTTCACCAACA R: TGCCTTCCTCTAGGTCCTTCAGC P: FAM -TGGTGTTTGGCACCTCGGACCGT -TAMRA GH 82 bp 本文件 牛 家牛、水牛 和牦牛 F: GTTGCCAGCCATCTGTTGTTTG R: ATTAGGAAAGGACAGTGGGAGTGG P: FAM -TCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGG -TAMRA GH 81 bp 本文件 羊 山羊和绵羊 F: TGCCAGCCATCTGTTGTTACC R: AAAGGACAGTGGGCACTGGAG P: FAM -CCCGTGCCTTCCTAGACCCTGGAAG -TAMRA GH 79 bp 本文件 家牛 家牛 F: GCAGGCATGCTGGGGATG R: CTAAGAACCAGGAGCGTGGACAG P: FAM -TACCCAGGTGCTGAAGAATTGACCCGG -TAMRA GH 135 bp 本文件 全国团体标准信息平台 T/CNHFA 002 —2022 3 名称 检测物种 引物序列 （5'--3'） 靶基因 扩增 长度 来源 水牛 水牛 F: TTCATTGAYCTCCCTGCTCC R: GGAATAGGCCGGTGAGGATT P: FAM -ACTTTGGCTCTCTCC -MGB cytb 100 bp SN/T3730.7 -2013 牦牛 牦牛 F: AACTTCGGCTCCATAGTAGGAGTA R: CGTCTCGGCAGATATGGACA P: FAM -CGGAGGAGAATGCTGTTGTTGTATCGGATGT -TAMRA cytb 124 bp BJS201904 山羊 山羊 F: GGAGGGAACTGAGGACCTCAGTG R: GGTGTGTGGTTCCCCTCACTG P: FAM -CCTTATTCGGAACCCTCCCCACCCCA -TAMRA GH 121 bp 本文件 绵羊 绵羊 F: CGGAGTAATCCTCCTATTTGC R: CTAGGCTTGTGCCAATATATGGA P: FAM -TATTACCAACCTCCTTT -MGB cytb 137 bp GB38164 -2019 8.2 三氯甲烷（氯仿）。 8.3 异丙醇。 8.4 Taq酶：5 U/μL。 8.5 UNG酶（尿嘧啶 -N-糖基化酶）。 8.6