ICS 65.020.01 B 38 TB 团 体 标 准 T/ NAIA 0123 -2022 苦豆子中 9种生物碱 的测定 高效液相色谱法 Determination of 9 alkaloids in Sophora alopuroides L． —High performance liquid chromatography 2022-07-01发布 2022-07-15 实施 宁夏化学分析测试协会 发 布全国团体标准信息平台 I前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020 《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》规定 编写。 本文件由宁夏 回族自治区 药品检验研究院提出 。 本文件由宁夏 化学分析测试协会归口 。 本文件起草单位：宁夏 回族自治区 药品检验研究院 、宁夏医科大学、 宁夏职业技术学院、宁夏农 林科学院、宁夏紫荆花制药有限公司。 本文件主要起草人： 马玲、尚博杨、雷艳、冷晓红、王汉卿、郑国保、马学琴、马宗卫、梁建宁、 撖志明、汪晓东、马小荣、王宁、马春燕、平吉文、王英华。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 2 全国团体标准信息平台 １ 苦豆子中9种生物碱 的测定 高效液相色谱法 1 范围 本文件规定了苦豆子中槐定碱、苦豆碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱、莱曼碱、 野靛碱和槐胺碱含量 的高效液相色谱测定方法 。 本文件适用于苦豆子中 上述 9种生物碱单个或多个成分含量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义 。 4 原理 试样中的生物碱类物质用 10% NaOH碱化后，经甲醇提取 ，用高效液相色谱法测定 ，外标法定量 。 5 试剂与材料 除另有说明 外，在分析中使用分析纯试剂和 GB/T 6682中规定的一级水 。 5.1 乙腈：色谱纯 5.2 三乙胺：色谱纯 5.3 磷酸二氢钾 5.4 甲醇 5.5 乙醇 5.6 氯仿 5.7 甲苯 5.8 10% NaOH溶液：称取 100 g NaOH，用水溶解并稀释至 1000 mL，混匀备用。 5.9 0.05 mol/L磷酸二氢钾 溶液：称取 6.805 g 磷酸二氢钾，用水溶解并稀释至 1000 mL，混匀备用。 5.10 标准品 全国团体标准信息平台 ２苦参碱、氧化苦参碱 、氧化槐果碱 、槐定碱、槐果碱 、苦豆碱、莱曼碱、野靛碱 、槐胺碱等标 准品的英文名称、分子式、 CAS号及纯度见附录 A。 5.11 单标储备溶液 分别准确称取 适量经真空干燥至恒重的苦豆碱、槐定碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、 槐果碱、莱曼碱 、野靛碱和槐胺碱 （精确到 0.00001 g），用甲醇溶解并 配制成质量浓度为 1 mg/mL 的单标储备 溶液，贮存于密闭容量瓶中 ，避光于4℃下储存。 5.12 混合标准储备溶液 分别吸取适量 9种生物碱 单标储备溶液 （5.11），用甲醇稀释苦豆碱、 槐定碱、氧化苦参碱、 氧化槐果碱 、苦参碱、槐果碱、莱曼碱、野靛碱和槐胺碱 浓度均为 100 μg/mL的混合标准储备溶液 。 贮存于密闭容量瓶中 ，避光于4℃下储存。 5.13 微孔滤膜 0.45 μm，有机相。 6 仪器与设备 6.1 高效液相色谱仪， 配有 DAD检测器。 6.2 分析天平 ，感量 0.00001g。 6.3 超纯水机 。 6.4 粉碎机。 6.5 超声波清洗仪。 7 试样制备与保存 苦豆子采集后分取各器官（根、茎、叶、花、籽）及全草样品阴干后，粉碎过 40目筛。 8 分析步骤 8.1 提取 取本品粉末 （过40目筛）0.5 g，精密称定（精确到 0.0001 g），置100 mL具塞锥形瓶中 ，加10% NaOH溶液（5.8）浸润 12 h后，精密加入甲醇 20 mL，密塞，称定重量，超声提取（ 功率 250 W， 频率 33 kHz）40 min，放置至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量 ，摇匀，用0.45 μm的滤 膜（5.13）过滤，取续滤液 上机测定 。 8.2 液相色谱参考条件 色谱柱： C18柱，长250 mm，内径 4.6 mm，粒度 5 μm (pH=1-11 )或相当者。 流动相 A：乙腈；流动相 B：0.05 mol/L磷酸二氢钾（ 2.0 ml/L三乙胺）；梯度洗脱条件见表 1。 检测器： 二极管阵列检测器（ DAD）。 检测波长 ：205 nm（苦豆碱、苦参碱、槐定碱、槐果碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、莱曼碱 ）， 全国团体标准信息平台 ３311 nm（野靛碱和槐胺碱） 。 进样体积： 10 μL。 柱温：25℃。 表 1 梯度洗脱程序表 时间（ min） 流速（ mL/min） 流动相 A（%） 流动相 B（%） 0 1.0 6 94 10 1.0 6 94 50 1.0 13 87 55 1.0 6 94 8.3 混合标准曲线的制备 精密吸取（5.12）项下混合 标准储备 溶液 2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL、6.0 mL、10.0 mL至 10 mL的容量瓶中 ，用甲醇稀释至刻度 ，摇匀，即得系列线性测定混合标准使用溶液 。取上述系列溶 液按（8.2）项的色谱条件进行测定， 记录峰面积， 以对照品溶液浓度（ C）为横坐标，峰面积 （A） 为纵坐标， 绘制标准曲线或求线性回归方程。 8.4 测定步骤 取平行两份的试样溶液测定，试样中各生物碱的响应值应在标准曲线范围内。以外标法计算生 物碱含量。 生物碱类混合 标准品溶液及试样溶液色谱图参见附录 B。 8.5 方法的检测限和定量限 本文件方法的检测限、定量限见附录 C。 9 结果计算 试样中槐定碱、苦豆碱、氧化苦参碱、氧化槐果碱、苦参碱、槐果碱、莱曼碱、野靛碱和槐胺 碱的含量按干燥品的百分含量计，按式（ 1）计算： 式（ 1）中： Ax——试样中各生物碱的峰面积。 CR ——各生物碱标准品的浓度，单位为克每毫升（ g/mL）。 AR ——各生物碱标准品的峰面积。 CX——试样溶液的浓度，单位为克每毫升（ g/mL）。 Cm——试样水分含量（ %）。 测定结果保留三位有效数字。 ）（ 含量 1 %100) 1( A% R   mXR X C CC A 全国团体标准信息平台 ４10 精密度 在重复性条件下， 获得的两次独立测定结果的绝对差值不超过算术平均值的 5%。 全国团体标准信息平台 ５ 附 录A （规范性附录 ） 9种生物碱中英文名称、分子式、 CAS号和纯度 9种生物碱中英文名称、分子式、 CAS号和纯度见表 A.1。 表A.1 9种生物碱中英文名称、分子式 、CAS号和纯度 序号 中文名称 英文名称 分子式 CAS号 纯度 1 槐定碱 SopHoridine C15H24N2O 83148-91-8 98.8% 2 苦豆碱 Aloperine C15H24N2 56293-29-9 ≥98.0% 3 氧化苦参碱 Oxymatrine C15H24N2O2 16837-52-8 92.9% 4 氧化槐果碱 Oxyso pHocarpine C15H22N2O2 26904-64-3 93.1% 5 苦参碱 Matrine C15H24N2O 519-02-8 98.7% 6 槐果碱 SopHocarpine C15H22N2O 6483-15-4 91.8% 7 莱曼碱 Lehmannine C15H22N2O 58480-54-9 ≥98.0% 8 野靛碱 Cytisine C11H14N2O 485-35-8 ≥98.0% 9 槐胺碱 SopHoramine C15H20N2O 6882-66-2 ≥98.0% 全国团体标准信息平台 ６附 录 B （资料性 附录） 9种生物碱 标准品溶液及试样溶液色谱图 9种生物碱 标准品溶液及试样溶液色谱图见图 B.1-B.4。 图B.1 311nm下2种生物碱标准 溶液色谱图 图B.2 311nm下试样溶液色谱图 标引序号说明： 1-野靛碱； 2-槐胺碱； 全国团体标准信息平台 ７ 图B.3 205nm下7种生物碱标准 溶液色谱图 图B.4 205nm下试样溶液色谱图 标引序号说明： 1.苦豆碱；2.槐定碱；3.氧化苦参碱 ；4.氧化槐果碱 ；5.苦参碱；6.槐果碱；7.莱曼碱 . A 全国团体标准信息平台