ICS11.020 CCSC05 团体标准 T/CRHA007—2022 健康献血者的单个核细胞资源储存规范 第4部分：单个核细胞的分离、处理与储存 Specificationformononuclearcellresourcestorageinhealthyblooddonors Part4：Isolation,processingandcryopreservationofmononuclearcells 2022-06-15发布 2022-07-01实施 中国研究型医院学会  发布 全国团体标准信息平台 T/CRHA007-2022 I目次 前 言............................................................................II 引 言...........................................................................III 1范围.................................................................................1 2规范性引用文件.......................................................................1 3术语和定义...........................................................................1 4基本原则.............................................................................1 5血液分离前准备工作...................................................................1 6分离与处理...........................................................................2 7记录.................................................................................4 参考文献.......................................................................5 全国团体标准信息平台 T/CRHA007-2022 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是《健康献血者的单个核细胞资源储存规范》的第4部分。 考虑到本文件中的某些条款可能涉及专利，中国研究型医院学会不负责对任何该类专利的鉴别。 本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。 本文件由中国研究型医院学会归口。 本文件起草单位：唐颐控股（深圳）有限公司、国家卫生健康委科学技术研究所国家人类遗传资源 中心、解放军总医院临床生物样本中心、中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）、 天津经济技术开发区唐颐细胞智造与神经创伤修复研究院、解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组 织再生研究中心、北京唐颐惠康生物医学技术有限公司、新乡医学院干细胞与生物治疗中心、深圳华大 基因细胞科技有限责任公司、唐颐惠康（深圳）生物医学技术有限公司、广州金域医学检验集团股份有 限公司、深圳知因细胞生物科技有限公司、北京艾颐生物科技有限公司。 本文件主要起草人：徐绍坤、曹毓琳、李国喜、王魁星、万桦、田亚平、赵秀梅、贺媛、程世翔、 马士卉、孙晓艳、林俊堂、周红梅、徐驰、梁文涛、江婧婧、李霞云。 全国团体标准信息平台 T/CRHA007-2022 III引言 近年来，随着细胞学、免疫学、分子生物学等技术的快速发展，免疫细胞疗法已作为一种安全有效 的治疗手段应用于临床，在肿瘤综合治疗中的作用尤为突出，成为继手术、化疗和放疗之后的第四大治 疗肿瘤较为有效的方法。当前，用于治疗的免疫细胞主要来自患者自体外周血分离的单个核细胞经过体 外的诱导扩增或工程化改造回输人体，这使得免疫细胞疗法在质量、数量和成本上成为制约其产业化应 用的瓶颈。健康人外周血中的单个核细胞资源具有极高的再利用价值。以往的采供血处理，将其作为医 疗废弃物进行处理，近些年，随着细胞生物技术发展和临床研究结果显示，人的机体免疫力随着年龄而 逐步衰减，尤其是外周血中的免疫细胞的成分和功能随着年龄的增长而变化。在青年阶段的健康人员的 外周血中的免疫细胞活性最强，借鉴于输血医学的理论基础，如何将该类细胞进行纯化并保存，为未来 诸多免疫疗法提供丰富的细胞资源，成为国内外研究的热点。 《健康献血者的单个核细胞资源储存规范》旨在规范健康献血者的单个核细胞资源储存活动，拟由 八个部分构成： ——第1部分：知情同意与供者筛查。 ——第2部分：采集与运输。 ——第3部分：供者血液样本检测。 ——第4部分：单个核细胞的分离、处理与储存。 ——第5部分：单个核细胞产品质量评价与放行。 ——第6部分：细胞资源储存设施的设计与建设。 ——第7部分：细胞资源储存设施设备的运行维护。 ——第8部分：数据电子信息化的管理。 通过对健康献血者的单个核细胞资源储存过程中的知情同意与供者筛查、采集、运输、样本检测、 分离、处理、储存、产品质量评价与放行、储存设施的设计与建设、储存设施设备的运行维护以及数据 电子信息化管理等进行规范，为从事单个核细胞资源储存业务的单位提供完整的参考。 全国团体标准信息平台 T/CRHA007-2022 1健康献血者的单个核细胞资源储存规范第4部分：单个核细胞的分 离、处理与储存 1范围 本文件规定了基于健康献血供者提供的外周血中的单个核细胞的分离、处理与储存基本原则、血液 分离前准备工作、分离与处理以及记录要求。 本文件适用于公共库健康供者单个核细胞的分离、处理与储存。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB50457医药工业洁净厂房设计规范 T/CMBA011—2020人外周血单个核细胞的采集、分离和保存 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 单个核细胞peripheralbloodmononuclearcell,PBMC 外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞、单核细胞、树突状细胞和其他少量细胞（造血干细胞 等）。 [来源：T/CMBA011—2020，3.1] 4基本原则 采用开放式分离操作时，外周血单个核细胞的分离和处理应至少在GB50457中洁净度等级为C 级背景下的A级环境中完成。 采用多联袋的全封闭分离操作时，外周血单个核细胞的分离和处理应至少在GB50457中洁净度等 级为D级背景下的环境中完成。 外周血采集抗凝剂宜优先采用肝素类抗凝剂。 外周血在进行分离处理前，其保存时限应不超过12h。 外周血的分离宜采用密度梯度离心法，可采用开放式分离或密闭分离系统。 5血液分离前准备工作 环境确认：洁净室和洁净工作台或生物安全柜应经紫外灯灭菌30min，并启动净化风机和空调系 统自净20min以上。 工作人员核对血液样本与采集信息内容的一致性，用75%的乙醇对采血袋外表面自下而上进行清 洁消毒，并放置传递窗自净15min后，传入分离、处理区域。 全国团体标准信息平台 T/CRHA007-2022 2 物料准备：取出所需的试剂及耗材放置物料推车上，放置于洁净工作台或生物安全柜旁边，待用。 核查确认所用试剂及耗材的批号是否在有效期内。 冻存液准备：自制冻存液宜采用含1%人血白蛋白和10%二甲亚砜（DMSO），需经验证符合外周血 单个核细胞冻存要求。使用前确认微生物培养72h以上结果为阴性；商品化的细胞冻存液使用前应核 查确认合格证和有效期，必要时需抽检微生物检测。 6分离与处理 开放式操作模式下的血浆及血细胞分离与处理 6.1.1在洁净工作台或生物安全柜内将全血血袋中的外周血转移到一次性无菌离心管中，将用完的血 袋热合，并2℃～8℃条件下留存7天，微生物检测无异常后按照医疗废弃物处置。 6.1.2将离心管中血液混匀后取0.5mL样本，进行全血计数。取1.5mL全血留样，送检“微生物限 度”。 6.1.3第一步离心：在室温条件（18℃～25℃）下、800g水平离心10min。 6.1.4血浆分离：离心完毕后，吸取上层血浆层并转移到一次性无菌转移袋中，贴上血浆编码，4℃条 件下暂存。 6.1.5下层血细胞稀释：用PBS或0.9%的生理盐水按照1:1体积比，稀释血细胞层，轻轻吹打混匀。 6.1.6铺层加样：将稀释的血细胞层缓慢匀速地加入到淋巴细胞分离液上方，两者比例约为1:1，铺 层的整个过程都应注意不能打破淋巴分离液与血液样本的分界面。 6.1.7第二次离心：在室温条件（18℃～25℃）下、800g水平离心20min，离心速度缓升缓降。 6.1.8单个核细胞提取：离心完毕后，离心管内出现明显分层，由下到上分别为红细胞层、淋巴细胞 分离液层、单个核细胞层、血浆生理盐水层；小心吸取单个核细胞层转移至一次性无菌离心管中，补 充PBS或0.9%的生理盐水，细胞悬液与PBS或生理盐水比例大约1:3，混