ICS11.020 CCSC05 团体标准 T/CRHA013—2022 经血源子宫内膜干细胞资源储存规范 第2部分：子宫内膜干细胞的分离、处理与 储存 Specificationformenstrualblood-derivedmesenchymalstemcellsresourcestorage- Part2：Isolation,processingandcryopreservationofmenstrualblood-derived mesenchymalstemcells 2022-06-15发布 2022-07-01实施 中国研究型医院学会  发布 全国团体标准信息平台 T/CRHA013-2022 I目次 前 言............................................................................II 引 言...........................................................................III 1范围.................................................................................1 2规范性引用文件.......................................................................1 3术语和定义...........................................................................1 4基本原则.............................................................................1 5分离前准备工作.......................................................................1 6分离、处理与储存.....................................................................1 7稳定性考察...........................................................................3 8记录.................................................................................3 参考文献.........................................................................5 全国团体标准信息平台 T/CRHA013-2022 II前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件是《经血源子宫内膜干细胞资源储存规范》的第2部分。 考虑到本文件中的某些条款可能涉及专利，中国研究型医院学会不负责对任何该类专利的鉴别。 本文件由中国研究型医院学会临床数据与样本资源库专业委员会提出。 本文件由中国研究型医院学会归口。 本文件起草单位：唐颐控股（深圳）有限公司、国家卫生健康委科学技术研究所国家人类遗传资源 中心、解放军总医院临床生物样本中心、中国医学科学院血液病医院（中国医学科学院血液学研究所）、 天津经济技术开发区唐颐细胞智造与神经创伤修复研究院、解放军总医院医学创新研究部创伤修复与组 织再生研究中心、北京唐颐惠康生物医学技术有限公司、新乡医学院干细胞与生物治疗中心、福建省妇 幼保健院、河南省妇幼保健院、深圳华大基因细胞科技有限责任公司、唐颐惠康（深圳）生物医学技术 有限公司、新疆乌鲁木齐妇幼保健院、广西壮族自治区妇幼保健院、安徽省妇幼保健院、深圳市妇幼保 健院、深圳市宝安区妇幼保健院、广东赛尔生物科技有限公司、北京艾颐生物科技有限公司、浙江卫未 生物医药科技有限公司。 本文件主要起草人：曹毓琳、赵秀梅、李国喜、徐绍坤、田亚平、贺媛、程世翔、马士卉、林俊堂、 曹华、赵鑫、孙晓艳、程国梅、薛淑媛、陈果、金平、何升、王心睿、徐凤萍、王魁星、刘斌、王泰华、 史辛艺、梁文涛、江婧婧、郝建秀、陈锦阳、李霞云。 全国团体标准信息平台 T/CRHA013-2022 III引言 健康人经血中的子宫内膜干细胞资源具有极高的利用价值。临床研究结果显示人的机体免疫力随着 年龄增长而逐步衰减，尤其是经血中的细胞成分和功能随着年龄的增长而变化。青年阶段健康人员经血 中的子宫内膜干细胞活性最强，如何将该类细胞进行纯化并保存，是国内外研究的热点。 《经血源子宫内膜干细胞资源储存规范》旨在规范经血源子宫内膜干细胞资源储存活动，拟由三个 部分构成： ——第1部分：采集与运输。 ——第2部分：子宫内膜干细胞的分离、处理与储存。 ——第3部分：子宫内膜干细胞产品质量评价与放行。 通过对经血源子宫内膜干细胞资源样本的采集、运输、分离、处理、储存以及产品质量评价与放行 等环节进行规范，提高干细胞产品质量。 全国团体标准信息平台 T/CRHA013-2022 1经血源子宫内膜干细胞资源储存规范第2部分：子宫内膜干细胞的 分离、处理与储存 1范围 本文件规定了基于健康供者提供的经血中的子宫内膜干细胞的分离、处理与储存基本原则、血液分 离前准备工作、分离与处理以及记录要求。 本文件适用于公共库健康供者的经血源子宫内膜干细胞的分离、处理与储存。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB50457医药工业洁净厂房设计标准 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 经血源子宫内膜干细胞menstrualblood-derivedmesenchymalstemcells,MenSCs 从女性月经血中脱落的子宫内膜组织分离的干细胞，可称为子宫内膜干细胞。 4基本原则 经血源子宫内膜干细胞的分离、处理应在满足GB50457中要求的洁净度等级为C级环境下的A 级环境中完成。 对经血样本进行分离处理前，其保存时限应不超过24h。 子宫内膜组织宜采用消化法进行细胞分离。 5分离前准备工作 环境确认：洁净室和洁净工作台或生物安全柜应经紫外灯灭菌30min，并启动净化风机和空调系 统自净20min以上。 工作人员核对样本与采集信息内容一致性，用75%的乙醇对采集瓶外表面自下而上进行清洁消毒， 并放置传递窗自净15min后，传入分离、处理区域。 物料准备：取出所需的试剂及耗材待用，核查确认批号及是否在有效期内。 培养液准备：自配培养液使用前确认微生物培养72h以上结果为阴性；商品化的细胞培养液使用 前应核查确认合格证和有效期。 6分离、处理与储存 全国团体标准信息平台 T/CRHA013-2022 2 分离与处理 6.1.1将采集瓶转移到洁净工作台或生物安全柜内中。 6.1.2将100m细胞滤网置于一次性离心管上，过滤采集的经血中的子宫内膜组织。 6.1.3过滤液送检无菌和支原体。 子宫内膜组织消化分离 6.2.1洗涤子宫内膜组织：将6.1.2过滤的子宫内膜组织用无菌有齿镊转移至一次性离心管中，加入 生理盐水冲洗，去除血渍。 6.2.2消化：用无菌组织剪将子宫内膜剪成1mm3～3mm3大小，0.1%Ⅰ型胶原酶37℃消化1h。 6.2.3将消化后的混合液过40m细胞筛网，收集滤液，在室温条件（18℃～25℃）下，500g水平离 心5min。 6.2.4细胞混悬液制备：离心完毕后弃上清，加入0.9%的生理盐水或DPBS定容，重悬并混匀。取样 并进行细胞活率及数量的计算。 6.2.5洗涤离心：在室温条件（18℃～25℃）下，500g水平离心5min。 细胞培养 6.3.1经6.2.5洗涤离心后弃上清，加入完全培养基，吹打混匀，按照5000～6000个/cm2的传代细胞 密度，平均接种到培养瓶中。 6.3.2每瓶补充完全培养基，平置培养瓶，使细胞尽量均匀分布，将培养瓶放置于二氧化碳恒温恒湿 培养箱。培养条件：37℃±0.5℃，二氧化碳体积分数为5%±0.2%。 细胞传代 6.4.1在倒置显微镜下观察细胞形态有无异常，细胞有无污染，如观察到细胞融合度达到70%～80%时， 即可进行消化收获传代。 6.4.2细胞清洗：弃去旧培养基，用0.9%的生理盐水或DPBS洗涤2次。 6.4.3细胞消化：培养瓶中加入0.125%胰酶-EDTA，每瓶1mL，轻摇，使每个培养瓶的消化液都能浸 润培养瓶底面。静置1min后，取出培养瓶轻轻拍打，取一培养瓶到倒置显微镜下观察，待见镜下细胞 变圆，大部分细胞脱落即表示消化可终止。 6.4.4终止消化：往培养瓶中加入消化终止液（含10%FBS的DMEM-F12培养基或完全培养基），进行 消化终止，将细胞和组织块的悬液转移至一次性离心管中，然后用0.9%的生理盐水或DPBS洗涤粘附在 培养瓶中的细胞残余，并转移至一次性离心管中（胰酶消化时间不宜超过5min）。 6.4.5洗涤离心：在室温条件（18℃～25℃）下，500g水平离心5min。 6.4.6细胞混悬液制备：离心完毕后弃上清，加入完全培养基定容，重悬并混匀。取样并进行细胞活 率及数量的计算。 6.