SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4577—2016 化妆品皮肤刺激性检测 重建人体表皮模型体外测试方法 Skin irritation test for cosmetics-Reconstructed human epidermal model in vitro alternative method 行业标准信息服务平台 2016-08-23发布 2017-03-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4577—2016 前 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准参照采用"经济合作与发展组织”发布的《化学品测试指南》第439号（OECDGuidelinesfor the testing of Chemicals No.439)。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国北京出人境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、中华人民共 和国广东出人境检验检疫局、中华人民共和国上海出人境检验检疫局、欧莱雅中国研发和创新中心 本标准主要起草人：曾静、马丹、苏宁、程树军、邱璐、蔡臻子、郑红艳、魏海燕、秦瑶、李小林、赵锷 李楠。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4577—2016 化妆品皮肤刺激性检测 重建人体表皮模型体外测试方法 1范围 本标准规定了化妆品和化妆品原料对人体皮肤刺激性体外测试方法。 本标准适用于化妆品和化妆品原料的安全性检测 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3术语、定义和缩略语 3.1 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 替代 alternatives 改善试验设计和提高试验效率以减少动物的应激（优化替代），减少某一试验所需动物的数量（减少 替代），以及完全停止某一试验的动物使用（代替替代），以及为实现上述目的进行的研究。 3.1.2 替代试验 alternatives testing 利用低等动物或利用离体器官培养的细胞或细胞器、生物模拟系统以优化、减少或替代传统的动 物试验，进行毒理学评价、功效性评价和其他生命科学研究。 准信息服 3.1.3 体外试验invitrotesting 用体外培养的细胞或组织进行的试验。 3.1.4 重建人体表皮模型 reconstructed human epidermal skin 采用人皮肤来源细胞利用组织工程学技术进行三维结构的重建，可获得与正常皮肤相似的结构和 功能。体外重建表皮模型能更好地模拟人体实际接触外源性化学物的情况，可用于替代活体动物进行 实验。 3.2 2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 MTT3-(4.5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenylTetrazoliumBromide 3-（4，5-二甲基-2-噻唑）-2，5-二苯基漠化四氮唑噻唑蓝，中文简称噻唑蓝 1 SN/T 4577—2016 4表皮模型体外替代试验法实验原理 4.1方法简要步骤 本标准使用重建人体表皮模型对化妆品、化妆品原料的皮肤刺激性进行检测。化学品和化妆品原 料与相应的表皮模型反应15min，冲洗干净，于37℃，5%CO2，95%相对湿度的CO2培养箱中，培养 42h后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。化妆品成品与相应的表皮模型反应 18h后，用MTT法对反应后的表皮模型进行细胞活性的测试。 4.2方法测试终点 测试终点是使用MTT法测定细胞活性，并以细胞活性是否超过50%来分类刺激性和非刺激性。 MTT是一种黄色染料，活细胞线粒体中玻珀酸脱氢酶还原MTT，在细胞色素C的作用下，生成蓝色 （或蓝紫色）不溶于水的甲（Formazan），用酶标仪在570nm处测定甲的量。通常情况下，甲生 成量与活细胞数成正比。因此，可根据570nm处OD值推算活细胞数，死细胞中不含琉拍酸脱氢酶， 不与MTT发生反应。然而，一些化妆品、化妆品原料直接与MTT作用，产生颜色反应，干扰实验结 果。因此，在开始测试前，首先测试化妆品、化妆品原料是否与MTT产生颜色反应，对于产生颜色反应 的化妆品、化妆品原料，用表皮模型的死皮作为对照。 5仪器和设备 5.1移液器：连续加样器和25mL、10mL吸头、M25活塞排代式移液器和相应吸头，100μL~ 1000L移液器和相应吸头、20L～200uL移液器和相应吸头。 5.2CO，培养箱：37℃±1℃，（5+1)%CO2，95%相对湿度。 5.3酶标仪：570nm。 5.4通风柜。 行业标准信息服 5.5超净工作台 5.637℃恒温水浴。 5.7摇床，70r/min。 5.8涡旋振荡器。 5.9计时器。 5.10大平（精度0.1mg）。 6试剂和材料 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，试验用水参照GB/T6682规定。 6.1EpiSkinTM表皮模型（包含：测试培养基、维持培养基、打孔器）。表皮模型产品应提供相关批次 的质检报告（如IC50或ET50），参见附录A。 6.2DPBS缓冲液：参见B.1。 6.3阴性对照:DPBS 6.4阳性对照：5%SDS 1）推荐使用该表皮模型，该产品购买于上海斯安肤诺生物科技有限公司，如有等效产品也可替代该款产品。 2