SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4525.5—2016 出口食品中致病菌的分子分型 MILST方法 第5部分：克罗诺杆菌 Multilocus sequence typing detection method for pathogens in export food- Part 5:Cronobacter spp 行业标准信息服务平台 2016-06-28发布 2017-02-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T 4525.5—2016 前 言 SN/T4525《出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法》共分10个部分： 第1部分：沙门氏菌； 第2部分：金黄色葡萄球菌； 第3部分：副溶血性弧菌； 第4部分：霍乱弧菌； 第5部分：克罗诺杆菌； 第6部分：化脓链球菌； 第7部分：空肠弯曲菌； 第8部分：致泻性大肠埃希氏菌； 第9部分：单核细胞增生李斯特氏菌； 第10部分：小肠结肠炎耶尔森氏菌。 本部分为SN/T4525的第5部分。 本部分按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、中华人民共 和国南京出人境检验检疫局。 本部分主要起草人：王、陈颖、赵晓燕、蒋原、薛峰、赵晓美。 行业标准信息服务平台 1 SN/T 4525.5—2016 出口食品中致病菌的分子分型 MLST方法 第5部分：克罗诺杆菌 1范围 SN/T4525的本部分规定了出口食品中克罗诺杆菌的分子分型MLST检测方法。 本部分适用于出口食品中克罗诺杆菌的分子分型检测 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.40—2010食品安全国家标准食品微生物学检验阪崎肠杆菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3术语和定义、缩略语 3.1术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1.1 管家基因house-keepinggenes 所有细胞中均要表达的一类基因，其产物是对维持细胞基本生命活动所必需的，其基因序列高度保 守并且在大多数情况下持续表达。又称看家基因，持家基因。 3.1.2 Taq DNA 酶Thermus aquaticus DNA polymerase 从Thermusaquaticus细菌中提取的耐热DNA聚合酶。 3.2缩略语 下列缩略语适用于本文件。 EDTA：乙二胺四乙酸(EthyleneDiamineTetraacetic Acid) MLST：多位点序列分型（multilocussequencetyping） ST:序列型(SequenceType) Tris：三（羟甲基）氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane] 4原理 MLST是通过测定多个管家基因中长度约为470bp核心片段的核苷酸序列，对其组合进行索引编 1 SN/T4525.5—2016 号，不同的菌株对应不同的序列型，从而揭示菌株间等位基因的多样性。MLST分型中多个管家基因 的序列分析比较在实验过程的操作性与结果的可靠性之间取得了平衡，且结果准确，所得数据在不同的 实验室间具有良好的可比性。 试剂和材料 除有特殊说明外，所有实验用试剂均为分析纯或生化试剂；实验用水符合GB/T6682中一级水的 要求。所有试剂均用无DNA酶污染的容器分装。 5.1EaTaqDNA聚合酶。 5.2dNTP:dATP、dTTP、dCTP,dGTP。 5.3DNA提取试剂:DNA提取试剂盒。 5.4 10XEα Taq Buffer(20 mmol/L MgCl,)。 5.5琼脂糖。 5.6 TAE缓冲液：2mol/LTris-HCI(pH8.4),1mol/L乙酸，100mol/LEDTA。 5.7 参考菌株：克罗诺杆菌ATCC29544。 仪器和设备 6.1 PCR扩增仪。 6.2离心机。 6.3 3核酸蛋白分析仪。 6.4电泳仪。 6.5 5分子凝胶成像仪。 6.6 微量移液器和灭菌吸头：10μL、100μL、200μL、1000μL。 6.7恒温培养箱。 6.8恒温水浴锅。 6.9 天平。 6.10 灭菌三角烧瓶：500mL，250mL。 6.11 6.12 灭菌试管：内径3mm，长5cm。 7检测程序 对克罗诺杆菌7对管家基因atpD、fusA、glnS、gltB、gyrB、infB、pps分别设计引物，并进行PCR扩 增（引物序列见表A.2），对扩增结果阳性的样品进行克隆测序，将所得到的克罗诺杆菌7对管家基因测 序结果上下游序列整合后得到完整序列，将测序结果上传至MLST网站（http：//www.mlst.net）进行 在线数据分析，得到的结果与MLST数据库进行比对，获得菌株所对应的等位基因图谱，确定克罗诺杆 菌分离株的序列型（SequenceType,ST)，并与PubMLST数据库中菌株的资料进行比较。在确定STs 的基础上应用MEGA程序对菌株进行聚类分析（参见附录B）。 MLST的操作程序见图1。 2