SN 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T4453—2016 出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型 SPA基因分型方法 SPA typing method 行业标准信息服务平台 2016-03-09发布 2016-10-01实施 中华人民共和国 发布 国家质量监督检验检疫总局 SN/T4453—2016 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：深圳市检验检疫科学研究院、中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、中华人民 共和国江苏出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：赵芳、洪小柳、刘慧玲、黄李华、吕敬章、葛丽雅、张恒、马淑棉、黄欣迪、蒋原、 薛峰、闫笑梅、张欢。 行业标准信息服务平台 1 SN/T4453—2016 出口食品中金黄色葡萄球菌的分子分型 SPA基因分型方法 1范围 本标准规定了金黄色葡萄球菌的SPA基因分型方法。 本标准适用于金黄色葡萄球菌的SPA基因分型。 2 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB4789.10食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CTAB十六烷基三甲基溴化铵（HexadecyltrimethylammoniumBromide） DNA脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleicacid) dNTP脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） EDTA 乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid) PCR 聚合酶链反应（polymerasechainreaction） SDS 十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate） SPA 葡萄球菌A蛋白（StaphylococcusproteinA) 酶DNA聚合酶 Taq Tris 三（羟甲基）氨基甲烷（trishydroxymethylaminomethane） 4原理 SPA是葡萄球菌细胞壁的一种表面蛋白，绝大多数金黄色葡萄球菌均含有SPA。编码SPA基因 的X区包含有2个～15个长21bp～27bP的重复序列，该区由于重复序列数日、重复序列特征及重复 序列的排列顺序不同而具有高度的多态性。SPA基因的X区具有良好的重复性和体内、体外稳定性， 适合用来基因分型。根据SPA基因序列设计引物对X区进行扩增，将扩增产物的测序结果进行比对 分析，从而达到分型的目的 5 试剂和材料 除另有规定外，所有试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。所有试剂均用 1 SN/T 4453—2016 无DNA酶污染的容器分装。 5.1DNA提取试剂：称取0.1gchelex100粉末，加入100mL灭菌蒸馏水，摇匀即可。 5.2RNase(核糖核酸酶）溶液（20mg/mL)。 5.3葡萄球菌溶菌酶溶液（1mgmL）。 5.4TE缓冲液:10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH8.0)。 5.5 5蛋白酶k溶液（25mg/mL）。 5.6 NaCl(氯化钠）溶液（5mol/L）。 5.7 三氯甲烷（氯仿）。 5.8酚。 5.9 异戊醇。 5.10 异丙醇。 5.11 10×PCR缓冲液：200mmol/LTris-HCl(pH8.0）,200mmol/L氯化钾 5.12 琼脂糖。 5.13 DNA分子量标记物（100bp~1000bp）。 5.14 血琼脂平板：见A.3。 5.15 CTAB-NaCI溶液:见A.1。 5.16 无菌生理盐水：见A.2。 9 仪器和设备 6.1 PCR仪。 6.2DNA测序仪。 6.3电泳装置。 6.4凝胶成像系统。 6.5电热仪。 6.6离心机：离心力不小于12000g。 6.7恒温培养箱：36℃土2℃。 6.8 移液器:2μL~10 μL、10 μL~100 μL20μL~200 μL、100 μL~1 000μL。 业标准信 7 检测步骤 7.1 样品制备、增菌培养和分离 服务平 7.2模版DNA的制备 7.2.1直接提取法 金黄色葡萄球菌经培养后，取增菌液1mL，加到1.5mL无菌离心管中，13000r/min离心5min， 一20℃备用以待检测。对分离到的菌落，可直接挑取加人50μLDNA提取液，再按照上述步骤制备 模版DNA以待检测。 7.2.2CTAB 法 金黄色葡萄球菌在血平板上36℃过夜培养后，挑取菌落用无菌生理盐水比浊到0.5麦氏单位； 2