ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 26-2020 口蹄疫病毒 O型、A型抗体管式化学发光免 疫分析检测方法 Tubular chemiluminescence immunoassay for detecting antibodies of foot and mouth disease virus serotype O and A 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 26 -2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任 。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院兰州兽医研究所，中国动物疫病预防控制中心 本文件主要起草人： 林密、包艳芳、孙雨、蒋韬、马军武、何继军、王传彬，陈夏辉、郭建宏、宋 晓晖，刘湘涛、杨林、李峰松、李昕、孙燕燕、杨光、贺华丽 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 26 -2020 1 口蹄疫病毒 O型、 A型抗体管式化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了口蹄疫病毒 O型、A型抗体管式化学发光免疫分析检测方法 的试剂、 仪器设备及耗材、 操作步骤、结果判定 。 本文件适用于检测猪、牛和羊等偶蹄动物血清中口蹄疫 O型、 A型病毒抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件 CLIA: 化学发光免疫分析法（ Chemiluminescence Immunoassay ） VNT：病毒中和试验（ Virus Neutralization Test） ELISA：酶联免疫吸附（ Enzyme Linked Immunosorbent Assay） LPBE：液相阻断 ELISA (Liquid Phase Block Enzyme Linked Immunosorbent Assay) SPCE：固相竞争 ELISA (Solid Phase Competition Enzyme Linked Immunosorbent Assay) 5 试剂 5.1 25×浓缩洗液洗液 ，按照附录 A.1配置 5.2 100×浓缩洗针液 ,按照附录 A.2配置 5.3 稀释液，按照附录 A.3配置 5.4 口蹄疫病毒 O型、 A型抗原 5.5 偶联捕获抗体的磁性微粒（捕获抗体：口蹄疫病毒 O型、 A型兔抗血清） 5.6 碱性磷酸酶标记的检测抗体（检测抗体：口蹄疫病毒 O型、 A型豚鼠抗血清 ） 5.7 口蹄疫病毒 O型、 A型抗体标准血清： 抗体含量均为 1280 U，按照附录 B.1、B.2制备 5.8 口蹄疫病毒 O型抗体质控血清 1：抗体含量范围应144 U~176 U，按照附录 C.1制备 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 26 -2020 2 5.9 口蹄疫病毒 A型抗体质控血清 1：抗体含量范围 应144 U~176 U, 按照附录 C.2制备 5.10 口蹄疫病毒抗体 质控血清 2：健康牛血清 ，抗体含量 ＜10 U, 按照附录 C.3制备，抗体含量的定 义以及与效价的对应关系 见附录 D 5.11 化学发光底物 6 仪器设备及耗材 —电子天平 —离心机 —可调单道移液器（ 100 μL、1 mL） —1.5 mL尖底离心管 —全自动化学发免疫分析仪 —反应杯 —专用样本架 —试剂船 7 操作步骤 7.1 样品采集 及保存 样品采集按照 NY/T 541 进行。无菌注射器静脉采血， 不少于 2 mL，用自然凝结法分离血清后，置 于无菌血清管中， 若在一周内检测，可置 2 ℃~8 ℃条件下保存，若超过一周检测，应置于 -20 ℃以下冷 冻保存。 血清样本运输时注意冷藏，确保样品有效。按照《兽医实验室生物安全技术管理规范》进行样品的 生物安全标识。 7.2 样品处理 取7.1中的样品， 12000 r/min，离心 2 min，取上清放于 1.5 mL尖底离心管中，体积应大于 300 μL， 待检；若样品中存在沉淀或絮状物等杂质，应离心去除杂质， 且避免出现泡沫。 7.3 检测前准备 7.3.1 溶液配制 洗液（ 1×洗液）：将本试剂盒配备的 25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水做 1:25稀释； 洗针液（ 1×洗针液）：将本试剂盒配备的 100×浓缩洗针液用无离子水或蒸馏水做 1:100稀释； 无离子水或蒸馏水均 应符合 GB/T 6682 的要求。 7.3.2 仪器准备 阅读仪器说明书， 按已经确定的条件设置好 仪器参数 ，放置相关试剂 、样本、所需耗材， 开始检测。 （具体设置方式参考仪器说明书） 。 7.3.3 标准曲线 拟合及校准 7.3.3.1 标准曲线拟合 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 26 -2020 3 倍比稀释 口蹄疫病毒 O型、A型抗体标准血清于 1.5 mL尖底离心管， 含量分别是 1280 U、640 U、320 U、160 U、80 U、40 U、20 U、10 U、5 U，血清稀释液 含量定位 0 U，按照 7.3.5进行检测，按 7.3.6做标 准曲线。标准曲线示例见附录 E。 7.3.3.2 标准曲线校准 取抗体含量 640 U、160 U、80 U、40 U、10 U高、中、低 5个点，按仪器说明书对标准曲线进行校 准。 以下情况需对标准曲线进行校准， 然后再进行检测： a) 试剂成分发生改变 ； b) 同一批次试剂盒 使用周期超过 28 d； c) 根据具体需要：如 质控结果不符合要求 。 7.3.4 质控 需要时检测质控血清，检测值必须在参考范围内，方可继续样品检测，如下情况需检测质控血清： a) 每次试剂成分发生改变或定标后 ； b) 至少 24 h内需检测 1次。 7.3.5 样品检测 a) 将样品架置入相应样品仓内，仪器自动吸 取10 μL待检样品、标准品、阴阳性血清加入反应杯； b) 加入 25 μL偶联兔抗的 磁性微粒 溶液、 180 μL口蹄疫病毒 O型、 A型抗原， 37 ℃孵育 10 min； c) 清洗 3次，加入 100 μL碱性磷酸酶标记的豚抗， 37 ℃孵育 10 min； d) 清洗 3次，加入 100 μL化学发光底物，孵育 3 min； e) 读取发光值，计算浓度。 7.3.6 结果 检测完成后， 按标准血清抗体含量为横坐标，检测 RLU值为纵坐标做四参数拟合标准曲线 。待检样 品检测 RLU值代入标准曲线，计算结果即为待检样本中口蹄疫 O、A抗体含量 。 a) 若质控血清检测结果 在参考范围内 ，则试验成立，可按检测显示结果判定样本阴阳性 。 b) 若质控血清检测结果不 在参考范围内 ，则需校准标准曲线，再进行检测。 8 结果判定 8.1 质控血清参考范围 质控血清 1含量为 144 U ~176 U，质控血清 2含量＜ 10 U，实验结果成立。 8.2 阴阳性判定依据 抗体含量 ≥70 U判为阳性； ≤28 U判为阴性； 28 U＜含量＜ 70 U判为可疑。可疑血清样品，可以重 测，重测抗体含量 ≥70 U，判为阳性，＜ 70 U判为阴性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 26 -2020 4 附 录 A (规范性) 试剂的配制 A.1 25×浓缩洗液 ，见表 A1： 表A1 25×浓缩洗液配方 名称 称量 丁二酸 1.98 g 六水丁二酸钠 62.16 g NaCl 225 g Tween -20 13.75 g 加灭菌蒸馏水至 600 mL，溶解，定容至 1000 mL，置于 2 ℃~8 ℃保存备用。使用时用无菌蒸馏水稀 释25倍为 1×洗液使用。 A.2 100×浓缩洗针液： 取50ml Tween -20，加灭菌蒸馏水至 600 mL，摇匀，定容至 1000 mL，置于 2 ℃~8 ℃保存备用。使 用时用无菌蒸馏水稀释 100倍为 1×洗针液使用。 A.3 稀释液，见表 A2： 表A2 稀释液配方 名称 称量 Na2HPO 4 1.15 g NaCl 8 g KH 2PO 4 0.2 g Tween -20 0.5 mL 加灭菌蒸馏水至 600 mL，溶解，定容至 1000 mL，置于 2 ℃~8 ℃保存备用。 蒸馏水均 应符合 GB/T 6682的要求。