ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 28-2020 猪瘟病毒微滴式数字 RT-PCR检测方法 Method of droplet digital RT -PCR for detection of classical swine fever virus 202-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 28 -2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 的规定 起草。 请注意本文件的某些内 容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心 、辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省葫芦岛市建 昌县现代农业发展服务中心 。 本文件主要起草人： 董浩、王传彬、杨林、宋晓晖、原霖、李硕、韩焘、毕一鸣、陈亚娜、陈瑶、 赵妍、郑文峰、于广秋。 中国兽医协会 CVMA 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 28 -2020 1 猪瘟病毒微滴式数字 RT-PCR检测方法 1 范围 本文件规定了猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）微滴式数字 RT-PCR检测方法 的原理、 试剂与耗材、仪器与设备 、操作步骤、结果分析 。 本文件适用于猪的脏器、血液、排泄物和细胞培养物中猪瘟 病毒野毒株和疫苗株核酸的精准定量 检 测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本 适用于本文件 ；不注日期的引用文件 ，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 微滴式数字 PCR（droplet digital PCR，ddPCR）的技术原理是利用微滴化技术将一份 反应体系 分成 数万个纳升级的微滴 进行定量 PCR检测，本质上 是将传统定量 PCR的一次检测变成数万次检 测， 提高了 检测的灵敏度和精准度。微滴发生器 可以将每一份扩增体系 分成数万个均匀的纳升级微滴，每个微滴不 含或者含有一个至数个待检核酸靶分子。每个微滴都 将作为一个独立的 PCR扩增体系，在 PCR扩增仪上 进行终点 PCR扩增。利用微滴分析仪逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为 1，没有荧光 信号的微滴判读为 0。然后根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检 靶分子的浓度或拷贝数。 5 试剂与耗材 5.1 提取试剂 宜选取商品化的 病毒RNA提取试剂盒 ，或选用其他等效提取核酸方法 。 5.2 微滴式数字 RT-PCR扩增试剂 宜按照不同的微滴式数字 PCR平台的说明书选取推荐的微滴式数字 PCR扩增试剂。 5.3 引物和探针 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 28 -2020 2 CSFV上游引物 （CSFVF）：5＇- ATGCCCAYAGTAGGAHTAGCA -3＇ CSFV下游引物 （CSFV R）：5＇- CTVCTGACGACTGTYCTGTAC -3＇ CSFV探针（CSFV P）：5＇-FAM - TGKCGAGCTCCCTGBGTGGTCTAA GT -BHQ1 -3＇ 5.4 阳性、阴性及空白对照 以含有 CSFV的RNA作为阳性对照；以未感染 CSFV猪的组织混样总 RNA作为阴性对照；以 无核酸 酶水作为空白对照。 6 仪器与设备 生物安全柜 、PCR扩增仪、数字 PCR微滴发生器 、数字 PCR微滴检测器。 7 操作步骤 7.1 样品采集及运输 按照 NY/T 541 执行。 7.2 样品处理 检测前样品应在二级生物安全柜中处理。 抗凝血样品：直接转入离心管中编号备用。 扁桃体样品和内脏样品： 取待检样品， 按 1:5倍体积加入 DEPC水， 于研钵或组织匀浆器中充分研磨， 3000 g离心 15 min，取上清液转入离心管中编号备用。 排泄物：挑取少许粪便样品于离心管中，加入适量生理盐水，震荡混匀，室温 3000 g离心 15 min， 取上清液转入离心管中编号备用。其它液体排泄物直接转入离心管编号备用。 细胞培养物：细胞培养物冻融 3次，转入离心管中编号备用。 7.3 RNA提取 使用病毒 RNA提取试剂盒 或选用其他等效提取核酸方法对样品进行 RNA提取。 7.4 微滴式数字 RT-PCR扩增方法 微滴式数字 RT-PCR扩增体系配制如表 1。 该步骤按照不同微滴式数字 PCR平台的说明书进行操作。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 28 -2020 3 表1 微滴式数字 RT-PCR扩增体系 试剂 终浓度 μmol/L 体积 μL 2×酶混合液a - 10 ASFV F（10 μmol/L ） 0.5 1 ASFV R（10 μmol/L ） 0.5 1 ASFV P（10 μmol/L ） 0.1 0.2 DNA模板 - 2 无核酸酶水 - 5.8 总体系 - 20 注：使用微滴式数字 PCR平台进行实验 时，应依据 不同微滴式数字 PCR平台说明调整 扩增体系的组分和最 终体积，并保证表中所列组分的终浓度不变。 a 微滴式数字 PCR扩增试剂。 反应液配制后，使用数 字PCR微滴发生器对扩增体系进行微滴生成。微滴生成 后，使用 PCR扩增 仪或荧光定量 PCR仪进行微滴式数字 RT-PCR扩增。 使用数字 PCR微滴检测器读取 PCR扩增结果， 荧 光分析步骤采用 FAM单荧光通道， 微滴式数字 RT-PCR扩增程序如表 2所示。 表2微滴式数字 RT-PCR扩增程序 步骤 温度 持续时间 循环数 1 42 ℃ 60 min 1 2 95 ℃ 10 min 1 3 95 ℃ 30 s 40 4 55 ℃ 1 min 5 98 ℃ 10 min 1 6 4 ℃ 60 min 1 注：升降温速率设置为2℃/s。 7.5 微滴式数字 RT-PCR反应的对照 在进行微滴式 数字 RT-PCR实验时，应设置 阳性对照、 阴性对照与空白对照。各对照 PCR扩增体系 中，除模板外，其余组分 和RT-PCR扩增程序 同7.4。 8 结果分析 8.1 实验成立条件 微滴式数字 RT-PCR扩增结果，有效微滴不得低于 理论微滴数的 60 %。阴性对照组 和空白对照组 均 未检出阳性微滴，阳性对照有明显阳性微滴， 且核酸拷贝数浓度大于 10 copies/ μL，则实验成立 。 8.2 阈值设定 微滴式数字 RT-PCR结果中，阴性微滴和阳性微滴明显分开，阈值设在阴性微滴 和阳性微滴分开的 区域。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 28 -2020 4 8.3 结果判定 样品中检测出阳性微滴 ，且阳性核酸拷贝数浓度≥ 10 copies/μL ，则判定为阳性。 样品中检测出阳性微滴 ，且阳性核酸拷贝数浓度＜ 10 copies/μL ，则需复检 。若复检结果仍 检测出 阳性微滴，则判定为阳性，否则判定为阴性。 样品中未检出阳性微滴 ，则判定为阴性。 9 实验室生物安全要求 9.1 本方法涉及实验室生物安全管 理要求见 GB 19489 。国家农 业行政主管部门另有规定的，按其规定 执行。 9.2 使用过的实验器材和液体废弃物应先经过消毒液浸泡处理，再经高温高压处理后按医疗废弃物进 行处理。剩 余样品等固体废弃物应在生物安全柜中密封包装，经表面消毒后移出，再经高温高压处理后 按医疗废弃物进行处理。 _________________________________ 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台