ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 33-2020 小反刍兽疫病毒抗体化学发光免疫分析检 测方法 chemiluminescent immunoassay for detection of peste des petits ruminants virus antibody 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 33-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》 的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、中国农业科学院兰州兽医研究所、洛阳现代生物技 术研究院有限公司、 青海省动物疫病预防控制中心 、新疆维吾尔自治区动物疾病预防控制中心、 新疆生 产建设兵团 省动物疫病预防控制中心、 江西省动物疫病预防控制中心、 黑龙江省动物疫病预防控制中心、 重庆市动物疫病预防控制中心、 甘肃省永昌县肉用种羊繁育 技术推广站 。 本文件主要起草人：孙雨、才学鹏、宋晓晖、王传彬、李秀梅、 满永恒、蔡金山、阚威、 窦永喜、 陈少渠、王睿男、肖颖、赵晓春、杨林、 张旭、孙航、刘亚涛、 王文、胡广卫、马英、毕一鸣、黄辉、 姚强、甘平 、张力、殷涛、 刘颖昳、 刘近、蒋菲、邹联斌、韦正吉、吕园园、林汉亮、李硕、 徐琦、胡 冬梅、原小燕、任雪建、刘明瑞、赵津子。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 33-2020 1 小反刍兽疫病毒抗体化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了小反刍兽疫病毒抗体的化学发光免疫分析检测方法 的试剂与材料、仪器与设备、技术 原理、实验前准备工作、操作步骤、试验成立标准、结果判定标 准等内容 。 本文件适用于动物血清中小反刍兽疫病毒抗体的检测 。 2 规范性引用 文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与材料 4.1 小反刍兽疫病毒重组蛋白 N抗原，按照附录 A制备 4.2 小反刍兽疫病毒单克隆抗体， 按照附录 B制备 4.3 酶结合物， 按照附录 B制备 4.4 包被缓冲液， 按照附录 C.1配制 4.5 封闭液，按照附录 C.2配制 4.6 酶结合物稀释液， 按照附录 C.3配制 4.7 校准品稀释液， 按照附录 C.4配制 4.8 校准品 1～校准品 6，按照附录 C.5～C.6配制 4.9 25倍浓缩洗涤液， 按照附录 C.7配制 4.10 化学发光底物 A，按照附录 C.8配制 4.11 化学发光底物 B，按照附录 C.9配制 5 仪器与设备 化学发光免疫分析仪、分析 天平、洗板机、 37 ℃温箱、 2 ℃~8 ℃冰箱、﹣20 ℃冰箱、单道微量移 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 33-2020 2 液器（ 0.5 µL~10 µL；10 µL~100 µL；20 µL~200 µL；100 µL~1000 µL） 、多道移 液器（ 300 µL）、NUNC 反应板、血清稀释板（ 96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培养板） 、一次性注射器（ 5 mL、10 mL）。 6 技术原理 采用竞争反应原理，包被板上包被重组蛋白 N抗原，待检样品中的特异性抗体和酶标记抗体竞争性 结合重组蛋白，待检样品中抗体剂量值的高低与发光信号值成反比，通过校准曲线拟合计算，即可得出 待检样品中抗体的剂量。 7 样品采集及处理 采集静脉血时，每头 羊使用一个注射 器。进行静脉无 菌采血，不少于 2 mL。倾斜放置于室温中静 置2 h~4 h，待血液自然析出血清，必要 时可低速离心（ 1000 r离心 10 min~15 min ） ，分离血清。采集的 血清样本低温保存、运输。 应符合 NY/T 541 的规定。 8 操作步骤 8.1 包被 使用包被缓冲液将小反刍兽疫病毒重组 N蛋白稀释。每孔加 100 μL。置于冰箱 4 ℃包被 16 h~24 h。 8.2 洗板 弃去包被液，用 300 μLPBST洗涤板孔 ，洗板 2次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。最后一次洗涤液 弃去后， 将包被板在吸水纸上拍 干，直至孔内无残 留洗涤液 。 8.3 封闭 每孔加入 150 μL封闭液，置于 4 ℃封闭 16 h~24 h。弃去封闭液，在吸水纸上拍干。 8.4 干燥 置于 37 ℃干燥 3 h~5 h。装入铝箔袋，加干燥剂，抽真空，置于 2 ℃~8 ℃保存备用。 8.5 加样 取出包被板 ，每次实验需设置系列校准品 6孔。首先在血清稀释板上依次加入校准品 1~6各30 μL， 其余各孔依次加入待检样品各 30 μL，再向以上各孔均加入 60 μL 酶结合物，震荡混匀；每孔吸取 75 μL 转移至包被板对应孔内。 8.6 温育 置37 ℃恒温培养箱中温育 29 min~31 min。 8.7 温育后洗板 取出反应板 ，弃去反应 液。用 300 μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤 5次。每次洗涤后应弃去孔内的液体。 在最后一次洗涤液 弃去后， 将包被板在吸水纸上拍干，直至孔内无残留 洗涤液。 8.8 加入底物 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 33-2020 3 每孔各加入 50 μL的化学发光底物 A和50μL的化学发光底物 B，振荡混匀（也可 将化学发光底物 A、 B等比例混匀后加 100 μL）。 8.9 静置 在15 ℃ ~25 ℃条件下避光静置 5 min。 8.10 读值 静置后 15 min内用化学发光仪读取发光值。 9 结果计算方法 以校准品 1至校准品 6的发光值为纵坐标， 对应的抗体剂量值 （ 0 NCU/mL、10 NCU/m L、20 NCU/m L、 50 NCU/m L、100 NCU/m L、200 NCU/m L）为横坐标，通过 ELISACalc软件绘制校准品的四参数拟合曲 线，四参数模式为 Y=(a -b)/[1+(x/c) *b]+d。将样本的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中小反刍 兽疫抗体的含量。 10 试验成立条件 将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进行四参数拟合， R2≥0.99，试验成立。否则， 试验不成立 。 11 结果判定 如果待测样品中抗体含量＜临界值 40 NCU/m L，样品应判定为小反刍兽疫病毒抗体阴性 ；如果样品 中抗体含量 ≥临界值 40 NCU/m L，则判定为小反刍兽疫病毒抗体阳性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 33-2020 4 附 录 A (规范性) 小反刍兽疫病毒重组 蛋白N抗原的制备 A.1 生产用菌液繁殖 将生产用菌种种子按 1:100比例转接含卡那霉素 (100 μg/m L)的LB液体培养基中，置 37 ℃培养至 OD600 nm值为 0.6。 A.2重组蛋白的诱导表达 将生产用菌液加入 IPTG至终浓度为 0.75 mmol/m L，16 ℃下继续诱导 12 h，收集诱导表达菌液。 A.3重组蛋白提取和纯化 将诱导后的菌液，在 2 ℃~8 ℃条件下、以 8000 r/min离心 10 min，弃上清，收集菌体沉淀，用 PBS （0.01 mol/L，pH值7.4）洗菌体沉淀三次，以 8000 r/min离心 10 min，用适量 PBS（0.01mol/L ，pH 值7.4）重悬菌体沉淀，在 150 W功率的超声波的作用下冰浴裂解，有效时间为 10 min，工作时间为 5s， 间隔 5s。将超声裂解物在 2 ℃~8 ℃、以 12000 r/min离心 15 min，保留上清。 将制备的上清穿过预处理过的 树脂柱，重复 5次~7次，依次用 10 mmol/ L咪唑缓冲液、 20 mmol/ L 咪唑缓冲液、 40 mmol/L咪唑缓冲 液、 60 mmol/ L咪唑缓冲液、 80 mmol/ L咪唑缓冲液、 100 mmol/ L咪 唑缓冲液、 200 mmol/ L咪唑缓冲液及 500 mmol/ L咪唑缓冲液对重组蛋白进行洗杂和洗脱， 收集洗脱液， 并洗脱产生的滤液通过 Superdex 200凝胶柱分子筛进行进一步精细纯化， 最后将纯化后的蛋白吸出加到 透析袋中（ 8kd）浸泡在 2 L的透析液中，过夜透析， -70 ℃保存。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 33-2020 5 附 录 B (规范性) 小反刍兽疫病毒酶标单克隆抗体的制备 及纯化 B.1 小反刍兽疫病毒单克隆抗体的制备 B.1.1 杂交瘤细胞繁殖 将生产用小反刍单抗细胞株用含有 15 %胎牛血清的高糖型 DMEM培养液（ pH值