ICS 11.220 B 41 团体标准 T/CVMA 34-2020 猪伪狂犬病毒 gB抗体化学发光免疫分析检 测方法 chemiluminescent immunoassay for detection of pseudorabies gB virus antibody 2020-12-22发布 2020-12-22实施 中 国 兽 医 协 会 发布 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 34-2020 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 -2020《标准化工作导则 第1部分：标准化 文件的结构和起草规则》 的规定起 草。 请注意本文件的某些 内容可能涉及专利。 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国兽医协会提出并归口。 本文件起草单位：中国动物疫病预防控制中心、河南省动物疫病预防控制中心、 江西省动物疫病预 防控制中心、广西壮族自治区动物疫病预防控制中心、 洛阳现代生物技术研究院有限公司、江苏省动物 疫病预防控制中心、西藏自治区动物疫病预防控制中心、黑龙江省动物疫病预防控制中心。 本文件主要起草人：孙雨、 毕一鸣、 王传彬、 闫若潜、 李秀梅、谢彩华、宋晓晖、 王睿男、马英、 蒋菲、赵晓春、 杨林、董永毅、李晓霞、邹联斌、韦正吉、姚强、孙航、黄辉、刘 颖昳、顾贵波、央珍、 徐琦、胡冬梅、 刘近、甘平、马震原、王淑娟、王华俊、吕园园、任雪建。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 34-2020 1 猪伪狂犬病毒 gB抗体化学发光免疫分析检测方法 1 范围 本文件规定了猪伪狂犬病毒 gB抗体的化学发光免疫分析检测方法 的试剂与材料、仪器与设备、技 术原理、实验前准备工作、操作步骤、试验成立标准、结果判定标准等内容 。 本文件适用于猪伪狂犬病毒 gB抗体的检测 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中 ， 注日期的引用文件， 仅该日期 对应的版本适用于本文件；不注 日期的引用文件，其最新版本 （包括所有的修改单）适用于 本 文件。 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范执行。 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 试剂与材料 4.1 猪伪狂犬病毒 gB重组蛋白， 按照附录 A制备。 4.2 猪伪狂犬病毒 gB单克隆抗体， 按照附录 B配制。 4.3 酶结合物， 按照附录 B配制。 4.4 封闭液， 按照附录 C.1配制。 4.5 包被缓冲液， 按照附录 C.2配制。 4.6 酶结合物稀释液， 按照附录 C.3配制。 4.7 校准品稀释液， 按照附录 C.4配制。 4.8 校准品1~校准品6，按照附录 C.5~C.6配制。 4.9 25倍浓缩洗涤液， 按照附录 C.7配制。 4.10 化学发光底物 A，按照附录 C.8配制。 4.11 化学发光底物 B，按照附录 C.9配制。 5 仪器与设备 化学发光免疫分析仪、分析 天平、洗板机、 37 ℃温箱、 2 ℃~8 ℃冰箱、﹣20 ℃冰箱、单道微量移 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 34-2020 2 液器（ 0.5 µ L ~10 µ L；10 µ L ~100 µ L；20 µ L ~200 µ L；100 µ L ~1000 µ L） 、多道移液器（ 300 µ L）、NUNC 反应板、血清稀释板（ 96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培养 板） 、一次性注射 器（ 5 mL、10 mL）。 6 技术原理 采用竞争反应原理，包被板上包被 gB重组蛋白，待检样品中的特异性抗体和酶标记抗体竞争性结 合重组蛋白，待检样品中抗体剂量值的高低与发光信号值成反比，通过校准曲线拟合计算，即可得出待 检样品中抗体的剂量。 7 试验前准备工作 7.1 样本采集及处理 采集静脉血时，每头猪使用一个注射器。建议进行静脉无菌采血，不少于 2 mL。室温静置于斜面 2 h，待血液自然凝固后，置 2 ℃~8 ℃冰箱中放置不少于 2 h，4000 r/min离心 10 min。用移液器小心吸出 上层血清。 7.2 血清样本的 保存与运输 血清样本若在一周内检测，可置 2 ℃~8 ℃条件下保存。若超过一周检测，应置于 -20 ℃以下冷冻 贮 存。运输时注意冷藏，确保样品有效。采集的血清样本可用冰袋或保温桶加冰密封等方式运输，运输时 间应尽量缩短。 应符合 NY/T 541 的规定。 8 操作步骤 8.1 包被 将0.52 mg/ mL的重组蛋白用包被缓冲液稀释为 1∶4000，以 100 μL/孔的量加入发光板中，置 2 ℃~8 ℃包被 12 h。 8.2 洗板 弃去包被液，用 300 μLPBST洗涤板孔 ，洗板 2次。每次洗涤后 应弃去孔内 的液体。最后一 次洗涤液 弃去后， 将包被板 在吸水纸上拍干 ，直至孔内无残留洗涤液 。 8.3 封闭 每孔加入 150 μL封闭液，置 37 ℃封闭 2 h。 8.4 干燥 弃去封闭液， 在吸水纸上拍干。 置于 37 ℃干燥 3 h~5 h。 装入铝箔袋， 加干燥剂， 抽真空， 置于 2 ℃~8 ℃ 保存备用。 8.5 加样 取出包被板。 每次实验需设置系列校准品 6孔。 首先在血清稀释板上依次加入校准品 1~6各30 μL， 其余各孔依次加入待检样品各 30 μL， 再向以上各孔均加 入60 μL 酶结合物， 震荡 混匀； 每孔吸取 75 μL 转移至包被 板对应孔内。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 34-2020 3 8.6 温育 置37℃恒温培养箱中温育 29 min~31 min。 8.7 洗板 将各孔的液体弃入废液筒，用 300 μL洗涤液洗涤板孔，共洗涤 5次，每次洗涤后应弃去孔内的液体。 最后一次洗涤液弃去后，将孔中残留的洗涤液在吸水纸上拍干。 8.8 加入底物 每孔各加入 50 μL的化学发光底物 A和50 μL的化学发光底物 B，振荡混匀（也可化学发光底物 A、B 等比例混匀后加 100 μL） 8.9 静置 在15 ℃ ~25 ℃条件下避光静置 5 min。 8.10 读值 静置后 15 min内用化学发光仪读 取发光值。 9 结果计算方法 以校准品 1至校准品 6的发光值为纵坐标， 对应的抗体剂量值 （ 0 NCU/mL 、5 NCU/mL 、12 NCU/mL 、 25 NCU/mL 、50 NCU/mL 、100 NCU/mL ）为横坐标，通过 ELISACalc 软件绘制校准品的四参数拟合曲 线，四参数模式为 Y=(a -b)/[1+(x/c) *b]+d。将样品的发光值代入校准曲线计算，即可得出样品中猪伪狂 犬病毒 gB抗体剂量值。 10 试验成立条件 将6个校准品的发光值与对应抗体剂量值进 行四参数拟合， R2≥0.99，试验成立。否则，试验不成 立。 11 结果判定 将样品的发 光值代入校 准曲线计算，即可得出样品中伪狂犬病毒 gB抗体的剂量值。如果样品中抗 体剂量值＜临界值 10 NCU/mL ，样品判定为阴性；如果样品中抗体剂量值 ≥临界值 10 NCU/mL ，则判定 为阳性。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 34-2020 4 附 录 A (规范性) 猪伪狂犬 gB重组蛋白的制备 将 E. coli -PRV-gB 基础种子接种于含有 Amp+（100 µ g/mL）LB 固体培养基中，置 37 ℃培养过 夜，挑取单菌落接种于含 Amp+（100 µ g/mL）LB 液体培养基，置 37 ℃摇床振荡培养至 OD600 nm 达 到 0.65，取 1 mL 菌液作为诱导前对照，随后再加入 IPTG 至终浓度为 1 mmol/L，继续诱导 5 h。收集 培养菌液，在 4 ℃条件下、以 5000 r/min 离心 5 min，留取 100 μL 上清，收集菌体沉淀，加入相同体 积2× SDS -PAGE Loading Buffer ， 充分涡旋混匀， 100 ℃煮沸 5 min后， 在 4℃条件下、 以 10000 r/min 离 心1 min，取 5 μL 进行 10 %的 SDS-PAGE 电泳，确定在 27 kDa 表达出目的蛋白，用 Western blot 方 法分析重组蛋白的抗原性。收集菌液，提取 重组蛋白并进行纯化。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 34-2020 5 附 录 B (规范性) 猪伪狂犬病毒 gB酶标单克隆抗体的制备 B.1 单克隆抗体的制备 B.1.1 杂交瘤细胞繁殖将生产用细胞株 6E9H7，用含有 15 %胎牛血清的高糖型 DMEM 培养液（ pH 值 7.0）制成细胞悬液，置 37 ℃、含 5 % CO 2 培养箱中培养， 48 h~72 h，细胞能够稳定分裂繁殖，可长成 单层。 B.1.2 小鼠腹水制备 选取 12周龄 ~16 周龄健康雄性 Balb/c小鼠，按 0.5 mL /只腹腔注射弗氏不完全佐剂， 7 d~10 d后 每只小鼠腹腔接种 l× 106个~5× 106个6E9H7 株杂交瘤细胞，经 7