ICS 65.020.30 CCS B41 T/YNSOZ 云 南 省 动 物 学 会 团体 标准 T/YNSOZ 006—2025 绿孔雀人工繁育中亲本配对选择技术规程 Technical code of practice pair selection in captive breeding of Pavo muticus 2025-11-12发布 2025-11-18实施 云南省动物学会 发布 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 006 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由中国科学院昆明动物研究所提出。 本文件由云南省动物学会（ YNSOZ）归口。 本文件主要起草单位：中国科学院昆明动物研究所、泰山学院、云南森林自然中心。 本文件主要起草人：董锋、何芸睿、刘程霞、刘日、单鹏飞、陆琳。 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 006 —2025 1 绿孔雀人工繁育中亲本配对选择技术规程 1 范围 本文件规定了绿孔雀（ Pavo muticus ）人工繁育中亲本配对选择的物理标识与分子鉴定技术要求， 旨在避免近亲繁殖。 本文件适用于绿孔雀人工繁育机构开展亲本配对工作 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 35892 实验动物 福利伦理审查指南 GB/T 37864 生物样本库质量和能力通用要求 GB/T 40664 用于高通量测序的核酸类样本质量控制通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 人工繁育 artificially breeding 经主管部门批准，依法开展的野生动物饲养与繁育活动 。 3.2 亲本配对 Parental pairing 为繁殖目的选择和配置父母本的育种过程 。 3.3 近亲繁殖 inbreeding 三代以内有亲缘关系的个体之间的交配繁殖 。 3.4 基因组 genome 生物体所含的全部遗传信息，真核生物中储存于 DNA分子中。 3.5 参考基因组序列 reference genome sequence 对某一物种基因组进行测序、拼接和组装后获得的代表性序列 。 3.6 全基因组重测序 whole-genome resequencing 对已有参考基因组的个体进行基因组测序，以识别遗传变异 。 3.7 遗传变异 genetic variation 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 006 —2025 2 同一物种个体间在 DNA序列上存在的差异 。 4 物理标识 4.1 标识对象 包括人工繁育的亲本、所产卵、孵化幼体及后代成体 。 4.2 标识材料 卵壳标记应使用环保无味记号笔。成体及幼体应使用耐用、不易脱落、便于识别的编码脚环。幼体 约在三月龄时更换为成体脚环 4.3 编码与档案管理 应统一编码，并建立物种谱系与繁育档案，记录内容见附录 A。 5 分子鉴定 5.1 鉴定对象 无法通过物理标识确定亲缘关系的绿孔雀个体 。 5.2原理 基于个体间基因组 DNA序列相似性评估亲缘关系 。 5.3 样品采集与保藏 5.3.1 样品采集应符合 GB/T 35892 -2018的规定。 5.3.2 操作人员应穿戴防护服，对翅缘静脉消毒后，使用一次性灭菌采血针与含 EDTA -K2的真空采 血管采集 50 μL –100 μL血样，采血后以酒精棉球按压止血。 5.3.3 样品应编号，记录采集时间、地点及个体标识，并按 GB/T 37864 -2019 要求保藏 。 5.4 基因组DNA制备 5.4.1 实验室条件应符合 GB 19489 -2008 与 GB/T 40664 -2021 的相关规定 。 5.4.2 DNA提取可采用传统方法（附录 B.1）或商业试剂盒。建库用 DNA应满足： a) 经1%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，长度不低于 2 kb； b) 紫外分光光度法检测 OD260/280 值为 1.8–2.0，浓度不低于 50 ng/μL，总量不低于 3 μg。 5.5 基因组重测序 合格DNA样本可送具备资质的商业机构或自行进行全基因组重测序。测序数据应满足： a) 绝大部分碱基质量值≥ 20； b) 每个体 clean data 量不低于 10 Gbp； c) Q20 ≥ 95%，Q30 ≥ 85%； 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 006 —2025 3 d) GC含量约 40%。 5.6 参考基因组选择 应选用最新发布的纯种绿孔雀参考基因组，可从 NCBI等公共数据库获取 。 5.7遗传变异数据提取 将重测序数据比对至参考基因组，提取高质量遗传变异位点（质控 方案参见附录C）。 5.8 亲缘关系鉴定 建议使用 VCFtools（0.1.16版） 中KING算法 （‘–relatedness2’ ） 计算亲缘系数 φ。若φ > 0.0442 ， 判定为三代以内近缘关系。应综合物理标识与分子鉴定结果构建完整谱系。 6 亲本配对选择 应选择谱系记录清晰、三代以外无亲缘关系的健康个体进行配对繁殖 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 006 —2025 4 附录A （资料性） 绿孔雀谱系和繁育档案样表 个体标 识号 来源 父本标识 号 母本标识 号 出生时 间 出生笼舍 号 性别 同巢个体 1 同巢个体 2 □野外 □繁育 □雌 □雄 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 006 —2025 5 附录B (资料性） DNA样品的提取与检测 B.1 使用传统方法提取血液或羽毛 DNA B.1.1 取5 µL～10 µL血液或1～3个来自同一个体的羽根 于1.5 mL离心管中 。如是羽根， 使用灭过菌的眼科剪剪碎。 B.1.2 加入 500 µL于4 ℃预冷的细胞裂解液（配方为： 100 mM Tris -HCl，5 mM EDTA ， 500 mM NaCl ，1% SDS，pH8.0），混匀悬浊液 。 B.1.3 向裂解产物中加入 20 µL蛋白酶 K溶液（ 10 mg/m L），混匀后，放入恒温混匀仪于 1 000 rpm混匀频率和 55 ℃消化 3 h以上，但不要超过 10 h。 B.1.4 将消化液温度降至室温，加入 200 µL醋酸钾溶液上下颠倒摇晃 20s左右，使其充分 混合。 B.1.5 放入普通高速离心机中 13 000 rpm离心 5min，使蛋白 /SDS复合物沉淀 。 B.1.6 将上清转移到另一干净 1.5 mL离心管中，加入 600 µL异丙醇，充分混合，用 13 000 rpm离心 5min收集 DNA沉淀。 B.1.7 倒去上清，加入 500 µ L 70％乙醇溶液，颠倒管子数次，用 13 000 rpm离心 3min。 B.1.8 倒去上清，在实验台上敞口放置 3min～10min促使残余乙醇挥发 。 B.1.9 将DNA沉淀溶解于 50 µL～100 µL双蒸水中，吸取 5 µL用于琼脂糖凝胶检测和核酸 定量检测，其余转入 -20 ℃保存。 B.2 DNA完整性检测 B.2.1 用双蒸水洗净制胶模板和梳子，调节水平，放在制胶平板上，向电泳槽中倒入 1XTAE电泳缓冲液，其量以没过电泳槽 0.2 cm为宜。 B.2.2 称取 1 g琼脂糖与 100 mL 1XTAE 缓冲液，加入到配胶用的三角烧瓶内，旋转摇晃均 匀。 B.2.3 微波炉内加热 2.5min，取出后加入一滴荧光染料，轻轻旋转以充分混匀凝胶溶液。 B.2.4 倒入胶槽，加入梳子，室温下放置 30min至凝胶完全凝结，小心向上拔出梳子，将 凝胶预浸在电泳槽内，静置 2min至加样孔内无气泡。 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 006 —2025 6 B.2.5 使用移液器取 1 µ L DNA样品，与 1 µ L 6× loading buffer （缓冲液） 混匀后，加入凝 胶的加样孔内。 B.2.6 接通电泳仪电源，保证加样孔的一端朝向负极， 150 V恒压运行 20min～40min， loading buffer （缓冲液） 中溴酚蓝代表的片段大小为 300 bp，电泳中保证该指示剂不要泳 动出凝胶。 B.2.7 电泳完毕，关闭电源，在凝胶成像仪紫外模式下观察电泳带及其位置，并与 DNA分 子量标准 Marker比较以判断 DNA样品的完整性。 B.3 DNA纯度和浓度测量 B.3.1 本文件采用的紫外分光光度计为 NanoDrop2000 ， 若用其它品牌和型号的仪器， 分析 步骤请参考具体说明书。 B.3.2 启动 NanoDrop2000 配套软件，设置检测样品为“核酸”，进入检测