1 ICS 11.220 CCS B44 T/YNSOZ 云 南 省 动 物 学 会 团体 标准 T/YNSOZ 003—2025 野生动物腺病毒纳米孔测序快速鉴定 技术规程 Technical regulation for rapid detection of wild animal adenoviruses based on nanopore sequencing 2025-11-12发布 2025-11-18实施 云南省动物学会 发布 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 003 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由 中国科学院昆明动物研究所 提出。 本文件由云南省动物学会（ YNSOZ）归口。 本文件主要起草单位： 中国科学院昆明动物研究所 。 本文件主要起草人： 杨丽萍、杨兴娄、李丰邑、赵锴 。 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 003 —2025 2 野生动物腺病毒纳米孔测序快速鉴定技术规程 1 范围 本文件规定了 野生动物样本中腺病毒纳米孔测序鉴定技术流程 。 本文件适用于 野生动物腺病毒的快速、分类鉴定 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法 GB/T 40974 核酸样本质量评价方法 LY/T 2360 陆生野生动物疫病危害性等级划分 GB/T 40458 用于病原微生物高通量检测的核酸提取技术规范 GB/T27025 检测和校准实验室能力的通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 野生动物 wild animal 自然环境下生长且未被驯化的动物， 包括天然分布在自然环境中的动物种或其种群， 以及出于保护、 管理和科研等目的人工驯养但尚未形成明显遗传变异的动物种或其种群。 3.2 腺病毒 adenovirus, AdV 无包膜的双链 DNA病毒，直径为 90～100 nm的颗粒，基因组是线性 双链 DNA，长度约为 26～48 kb， 基因组两端各有长约 100 bp的反向重复序列 。 腺病毒科成员可感染包括人类在内的各种脊椎动物。 3.3 腺病毒DNA样品 AdV DNA samples 利用野生动物的组织、血液、咽拭子、肛拭子等样品进行核酸提取所获得的腺病毒基因组 DNA。 3.4 DNA文库构建 DNA library construction 将提取或纯化的基因组双链 DNA，经修复连接测序接头后磁珠纯化完成文库的构建，从而实现在 纳米孔基因测序平台进行测序的文库。 3.5 纳米孔测序 nanopore sequencing 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 003 —2025 3 纳米孔测序是一种基于单分子实时检测的测序技术， 其核心原理是通过监测生物大分子 （如 DNA、 RNA）穿过纳米孔时引起的电流变化来识别碱基序列。 3.6 病毒DNA序列分析 viral DNA sequence analysis 通过纳米孔测序仪对病毒 DNA进行测序，得到的 DNA序列与已知病毒序列数据库比对来确定病毒 的类型。 3.7 测序接头 sequencing adapter complex 在纳米孔测序中，测序接头是一段人工设计的、连接在待测 DNA片段末端的寡核苷酸序列。核心是 能特异性地、牢固地结合测序芯片上马达蛋白的耦联马达蛋白。 3.8 序列比对 sequence alignment 利用计算机算法和程序，确定两个或多个核苷酸序列的相似性及同源性。 3.9 单次测序准确率 single read accuracy 在未经过任何生物信息学校正的情况下，单次 DNA或RNA分子穿过纳米孔时，其序列被正确识别 的碱基比例。它衡量的是从原始电信号到碱基序列这一步转换的原始正确率。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 AdV：腺病毒（ adenovirus ） DNA：脱氧核糖核酸（ deoxyribonucleic acid ） RNA：核糖核酸（ ribonucleic acid ） RNase I：核糖核酸酶 I（ribonuclease I ） PCR：聚合酶链式反应（ polymerase chain reaction ） 5 野生动物腺病毒纳米孔测序快速鉴定试验步骤 技术流程可按附录 A中图 A.1所述方法进行。需用到的主要仪器、耗材、试剂见附录 B。 5.1 野生动物 样本核酸提取 5.1.1 核酸提取 a) 核酸提取应保证核酸的完整性。排除其他分子，如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等的污染， 保证后续纳米孔基因检测试验顺利进行。具体要求应符合 GB 19489 中的规定。 b) 基因组 DNA提取可使用磁珠法或等效的核酸提取试剂盒。核酸提取试剂盒应实现病毒颗粒破 裂、核酸释放、分离、纯化等。本标准采用商品化的自动核酸提取仪和适配的核酸提取试剂盒提取样本 核酸。详细提取方法及步骤按照说明书或参照附录 C。 5.1.2 质量控制 a) 在核酸提取过程中，应在生物安全柜中并注意人少走动时进行，防止空气中的核酸污染，所用 设备和耗材应无核酸酶污染，同时使用空白采样液作为阴性对照、具有代表性的非致病性微生物标准物 质/标准样品作为阳性对照同时进行提取。按照 GB/T 40974 的要求对提取的核酸进行检测与质量控制。 b) 提取的 DNA样本用核酸蛋白定量仪测定，核酸浓度宜≥ 15 ng/ μL，核酸总量宜≥ 300 ng。DNA 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 003 —2025 4 完整度较好，组织、血液等样本提取的核酸 OD260/OD280 比值范围宜在 1.8～2.0；OD260/OD230 比值 范围宜在 2.0～2.2；粪便、肛拭子样本提取的核酸 OD260/OD230 比值范围宜在 1.5～2.0。达到上述条 件的高质量 DNA宜进行核酸建库反应。否则为风险建库。 c) 满足试验要求的 DNA样本应置于 -20 ℃以下条件保存。一般不超过 7 day，超过 7 day应保存 于-80 ℃超低温冰箱中。 DNA样本使用时，取样不应超过 3次，避免样本反复冻融。 5.2 病毒DNA文库构建 a) 根据测序仪要求选择合适的建库试剂盒，按照建库试剂盒说明书对符合要求的核酸进行文库制 备。方法及步骤按照说明书或参照附录 D。 b) 为了得到高质量的测序结果， 建库时加入标准物质 /标准样品作为质量控制标准； 文库浓度需达 到文库质量检测合格的条件。病毒 DNA文库的核酸浓度宜≥ 2 ng/ μL，核酸总量宜≥ 25 ng。 c) 纳米孔测序的特点是对文库片段长度没有限制，长短片段都可测序。满足上述条件的 DNA文 库可直接进行病毒 DNA测序反应或放于 -20 ℃冰箱保存。 5.3 病毒DNA测序 a) 根据测序仪要求选择合适的测序试剂盒，按照测序试剂盒说明书标准化流程进行测序反应。方 法及步骤按照说明书或参照附录 E。 b) 根据纳米孔基因测序仪控制软件使用说明书实现测序控制。 c) 测序数据量宜大于 1 GB。选择合适的数据质量控制软件，对测序数据进行质量控制。质量控制 内容包括但不限于去除低质量数据、接头序列等。合格测序数据应满足以下条件：单次测序准确率≥ 97%，一致性准确率（ 70X）≥ 99.99%。 5.4 病毒种类鉴定及全基因组信息获取 5.4.1 野生动物病毒参考基因组数据库 野生动物病毒 参考基因组数据库是与试验数据比对的参比数据集。 5.4.2 野生动物 病毒基因组序列比对及鉴定 a) 采用我们自主开发的基于野生动物病毒参考基因组数据库的实时序列鉴定平台快速准确地分 类比对基因组序列。 b) 测序核酸上机 2～3 min内，平台程序会自动识别测序输出文件夹中的改变，每当一条 DNA序 列被测序输出后，自动启动通用系列对比程序 minimap2 与参考数据库进行比对。比对结果中出现腺病 毒的参考序列时，则可以判定为腺病毒病毒序列。计算机后台统计的比对结果累计输出至交互界面，直 至测序完成。 5.4.3 野生动物病毒全基因组获取 提取已鉴定为同种病毒的纳米孔测序短片段碱基对读数到以该种病毒命名的 fasta/fastq 文件夹并标 注。 5.4.3.1 提取已鉴定为同种病毒的纳米孔测序短片段碱基对读数到以该种病毒命名的 fasta/fastq 文件 夹并标注。 5.4.3.2 有参拼接当前测序仪生成的原始碱基系列片段，可以拼接到的最长片段碱基对读数。 5.4.3.3 以该最长片段碱基对读数为参考序列，对总的测序原始碱基再次比对，以发现漏掉的与数据 库相似度不