ICS 65.020 CCS B45 T/YNSOZ 云 南 省 动 物 学 会 团体 标准 T/YNSOZ 001—2025 怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程 A Code of Practice for Rhinopithecus strykeri population genetic archives 2025-11-12发布 2025-11-18实施 云南省动物学会 发布 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 001 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本文件由云南大学提出。 本文件由云南省动物学会（ YNSOZ）归口。 本文件主要起草单位：云南大学。 本文件主要起草人：于黎、匡卫民、李圆、骆佳。 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 001 —2025 2 怒江金丝猴种群遗传档案建立技术规程 1 范围 本文件规定了怒江金丝猴粪便 DNA的提取、物种鉴定、个体识别、种群遗传档案建立和管理使用。 本文件适用于云南省怒江金丝猴种群遗传档案建立。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 线粒体控制区 mitochondrial control region 线粒体控制区，也称为线粒体 D-loop区，是线粒体基因组的非编码 DNA 区域，突变速率较高。 3.2 微卫星序列 microsatellite sequence 在基因组中，由 1–6个核苷酸为基本单元构成的串联重复序列，例如（ AC）n、（ACG）n、（ATTT） n 等， 统称为短串联重复序列 （ Short Tandem Repeats, STR ） 或简单重复序列 （ Simple Sequence Repeats, SSR）。这类序列中，其重复单元数目在个体间存在差异的多态性位点，可作为微卫星标记用于遗传分 析。 3.3 脱氧核糖核酸样品 DNA samples 指利用动物组织或粪便提取的基因组 DNA，本标准中是指利用怒江金丝猴组织（如毛发、血液、肌 肉组织等）或新鲜粪便提取的基因组 DNA。 3.4 微卫星个体识别 microsatellite individual identification 采用微卫星技术， 判断两个或多个生物学样品是否来源于同一个体。 采用微卫星技术进行个体识别， 以确认个体身份。 4 基本要求 实验室应满足 GB 19489 -2008 中关于一级或以上级别生物安全实验室的要求。 5 粪便DNA的提取、检测和保存 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 001 —2025 3 5.1 粪便的DNA提取 按照 DB53/T 1058 -2021规范的粪便样本采集，获得怒江金丝猴粪便样本。然后， 使用商品试剂盒从 怒江金丝猴粪便中进行总 DNA提取，提取步骤见附录 A。 5.2 DNA质量检测 采用 1%琼脂糖凝胶电泳、 Nanodrop 2000 分光光度计、 Qubit荧光定量系统或核酸片段分析仪对提取 的DNA样本进行质量检测。合格的 DNA样本应满足以下标准： A260/A280 比值介于 1.7-2.1之间， A260/A230 比值不低于 2.0，浓度≥ 10 ng/μL，且琼脂糖凝胶电泳图谱显示清晰完整的主条带。未同时满 足上述所有指标的样本视为不合格。琼脂糖凝胶电泳检测与成像方法详见附录 B。 5.3 DNA保存 DNA样本可于 -20°C条件下短期保存；需长期保存时，应置于 -80°C超低温冰箱中。所有保存过程 均需严格避免样本的反复冻融。 6 遗传标记 6.1 线粒体标记 使用扩增线粒体 控制区的引物，对怒江金丝猴粪便 DNA样品进行 PCR扩增，扩增序列长度为 622 bp 左右，引物序列见附录 B。 6.2 微卫星序列 对线粒体标记 PCR扩增成功的个体进行个体识别，使用附录 C中的 10个微卫星序列对样品进行个体 识别。 7 线粒体标记 PCR扩增 7.1 引物合成 将7.1规定的怒江金丝猴线粒体标记序列送至相关生物公司合成引物 。 7.2 线粒体标记 PCR扩增的反应体系及程序 可选用多种适用于 PCR反应的酶进行 PCR扩增， PCR反应体系及程序见附录 D。 7.3 PCR产物质量检测 PCR扩增反应结束后， 取 2 µL扩增产物， 通过 2%琼脂糖凝胶电泳进行质量验证。 若样本呈现清晰、 片段大小符合预期（具体参照附录 C所示参考范围）的特异性条带，且阴性对照无扩增条带，则判定为 PCR扩增成功。符合质量标准的产物直接用于后续测序分析；未通过质检的样本，需系统优化 PCR反应 体系组成与反应时间等参数，重新进行扩增并完成质量验证 。 7.4 PCR扩增序列的获取 对符合质量标准的 PCR产物进行测序，随后利用专业生物学软件对测序成功获得的序列进行校对 与拼接。拼接完成后，需去除序列两端因测序质量不佳（如出现多峰或杂峰信号）的区段，以获取可用 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 001 —2025 4 于后续分析的高质量序列数据。 8 物种鉴定 利用 NCBI(美国国立生物技术信息中心 )的GenBank 数据库的 Blast搜索程序对待鉴定个体的 DNA序 列进行比对分析，根据序列相似度来确定待测样品是否来源于怒江金丝猴，序列相似度大于 98%可确定 为待测样品为怒江金丝猴。 9 个体识别 9.1 微卫星序列 PCR引物合成与荧光标记 将10个微卫星序列送至相关生物公司合成引物，每个微卫星序列有一条引物进行荧光标记，微卫星 序列及引物信息见附录 C。 9.2 微卫星序列 PCR扩增的反应体系和扩增程序 可选用多种适用于 PCR反应的酶进行 PCR扩增， PCR反应体系及程序见附录 D。 9.3 PCR产物的质量检测 PCR扩增反应结束后，采用 2%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行质量检测。若样本呈现单一、位置正 确的特异性条带，则判定该 DNA样本扩增成功。符合质量标准的 PCR产物使用锡箔纸盒避光包装，并于 4℃条件下保存，以备后续基因分型使用；未通过质量检测的样本，则需系统优化 PCR反应条件，重新 进行扩增与质检流程。 9.4 微卫星分型 9.4.1 将符合质量要求的 PCR产物送至有关公司进行基因扫描分型：不同颜色标记引物的 PCR产物或 者相同颜色标记但 PCR产物长度明显不重叠的可以混合后进行基因扫描分型。 9.4.2 应使用相同型号的设备和分子内标对所有样品进行基因分型，获得的数据应使用同一软件进行 数据判读，以此消除系统误差。得到微卫星分型结果时，应根据各微卫星位点重复单元碱基数对进行人 工校正，以确保数据的真实可靠性。 9.5 个体识别 采用 Cervus软件对 10个微卫星位点的分型数据开展个体识别分析，设定最小匹配位点数为 9，允许 模糊匹配数为 1。个体判定标准如下：若两个及以上样本的微卫星分型结果完全一致，则判定为同一来 源个体；若两个样本在两个及以上位点的分型结果存在差异，则判定为不同个体；若两个样本仅在一个 位点存在分型差异，则对该差异位点进行 2-3次重复 PCR扩增与基因分型验证 ——若重复结果一致，判 定为同一来源个体；若重复结果仍存在差异，则判定为不同个体 。 10 种群遗传档案内容 10.1 采样数据 包括采样时间、采样人、样品编号、样品地理坐标等， 参考 DB53/T 1058 -2021。 10.2 线粒体标记测序数据 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 001 —2025 5 包括样品编号、测序结果、测序图等。 10.3 微卫星序列分型数据 包括样品编号、微卫星序列编号、分型图、个体识别微卫星分型数据等。 11 种群遗传档案数据的管理和使用 在开展怒江金丝猴个体识别、种群遗传档案构建与种群遗传管理等工作中，可采用本标准所规定的 分子标记体系。各保护区及相关保护机构应按照规范获取本机构管辖范围内的遗传学数据，并进行系统 归档与妥善保存。基于所获得的遗传数据，可实现对怒江金丝猴的物种与个体分子鉴定、种群遗传多样 性评估、近交系数测算以及系统性遗传管理，从而有效监测种群间基因流动态与近亲繁殖风险，避免近 交衰退，科学维持怒江金丝猴种群遗传多样性水平。 全国团体标准信息平台 T/YNSOZ 001 —2025 6 A A 附录 A （资料性） 怒江金丝猴粪便样品 DNA提取方法 A.1 总DNA样品的提取步骤 本文件用商用试剂盒进行总 DNA样品的提取，提取步骤如下（按照说明书进行步骤优化）： 12 于2 mL离心管中加入 180 mg～220 mg粪便、直径 1.0 mm的研磨钢珠 3～4个、1 mL InhibitEX Buffe