ICS 67.160.10 X 62 团 体 标 准 T / N A I A 0 2 6 —2 0 2 1T/ NAIA 048-2021 功能性饮料中维生素B 12的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of vitamin B 12 in fµnctionaL beverage, LC-MS/MS 2021-05-30发布 2021-06-01实施 宁夏化学分析测试协会 发 布 发布TB 全国团体标准信息平台 前 言 本文件按照 GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则 》 的规定起草。 本文件由宁夏化学分析测试协会提出并归口。 本文件起草单位：宁夏菲杰特检测有限公司、宁夏化学分析测试协会。 本文件主要起草人：朱斐全、张海星、李亚辉、张小飞。 本文件为首次发布。 全国团体标准信息平台 功能性饮料中维生素 B12的测定 液相色谱 -质谱/质谱法 1 范围 本文件规定了功能性饮料中维生素 B12的液相色谱 -质谱 /质谱测定方法。 本文件适用于功能性饮料食品中维生素 B12的测定。 本方法功能性饮料取样量为 50.0 g时，方法检出限为 0.06 µg/kg。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 。其中，注日期 的引用文件 ，仅该日期对应的版本适用本文件 。不注日期的引用文件 ，其最新版本 （包括所 有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682-2008 《分析实验室用水规格和试验方法》 GB/T 5009.217-2008 《保健食品中维生素 B12的测定》 3 术语和定义 4 原理 采用维生素 B12免疫亲和柱对试样提取液中维生素 B12进行富集并去除部分杂质，经超 高效液相色谱 -质谱 /质谱法，正离子模式进行测定，外标法定量。 5 试剂与材料 5.1 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为 符合 GB/T 6682 -2008中规定的一级水。 5.1.1 甲醇（ CH 3OH）：色谱纯。 5.1.2 乙酸铵（ C2H7NO 2）：色谱纯。 5.1.3 氢氧化钠（ NaOH）。 5.1.4 柠檬酸（ C6H8O7）。 5.1.5 磷酸二氢钾（ KH 2PO 4）。 5.1.6 乙醇（ C2H6O）。 5.2 试剂配制 5.2.1 氢氧化钠溶液（ 1 moL/L）：称取 4.0 g氢氧化钠固体颗粒，加适量水溶解后，冷却后 用水稀释至 100 mL，混匀备用。 全国团体标准信息平台 5.2.2 氢氧化钠溶液（ 0.1 moL/L）：准确移取 10.0 mL 1 moL/L氢氧化钠溶液，用水稀释 并定容至 100 mL，混匀备用。 5.2.3 磷酸缓冲液（ pH 6.5）：称取 0.68 g磷酸二氢钾， 加0.1 moL/L氢氧化钠 15.2 mL，加 水溶解， 再用水稀释并定容至 100 mL，混匀备用 5.2.4 乙醇溶液（ 5 %）：准确移取 5.0 mL乙醇，用水稀释至 100 mL，混匀备用。 5.2.5 乙酸铵溶液 （10 mmoL/L）：称取 0.77 g乙酸铵，加水溶解后 ，再用水稀释并定容至 1000 mL后，混匀，经过滤、超声脱气后备用。 5.3 标准品 维生素 B12标准品（ C63H88CoN 14O14P，CAS号：68-19-9）：纯度≥98.0%，或经国家认 证并授予标准物质证书的标准物质。 5.4 标准溶液配制 5.4.1 维生素 B12标准储备液： 称取维生素 B12标准品 10 mg（精确到 0.0001 g），用5 %乙 醇溶液溶解， 并定容至 10 mL棕色容量瓶中， 既得 1 mg/mL的标准储备液，冷藏保存。 5.4.2 维生素 B12标准中间液： 精密移取 0.1 mL维生素 B12标准储备液于 10 mL容量瓶中， 用水定容至刻度， 摇匀既得 10 µg/mL的标准中间液，冷藏保存。 5.4.3 维生素 B12标准使用液： 精密移取 0.1 mL维生素 B12标准中间液于 10 mL容量瓶中， 用水定容至刻度， 摇匀既得 1 µg/mL的标准使用液，冷藏保存。 5.4.4 维生素 B12系列标准工作液： 分别精密移取一定量的维生素 B12标准使用液于 10 mL 容量瓶中，用水定容至刻度， 配成最终浓度为 0.5 ng/mL、1.0 ng/mL、10.0 ng/mL、20.0 ng/mL、50.0 ng/mL、100 ng/mL、200.0 ng/mL的系列标准工作溶液 ，供高效液相色谱 -质谱 / 质谱仪测定。（临用现配） 5.5 材料 5.5.1 一次性微孔滤头： 0.22 µm，水相。 5.5.2 免疫亲和净化柱： 维生素 B12免疫亲和净化柱，规格： 1000 ng/3mL，或相当者。使 用前先用10 mL水淋洗小柱中未键合的化合物。 6 仪器和设备 6.1 高效液相色谱 -质谱 /质谱仪。 6.2 分析天平： 感量 0.001 g和0.0001 g。 6.3 超声波清洗机。 6.4 离心机：转速≥ 4000 r/min。 全国团体标准信息平台 6.5 氮吹仪。 7 试样制备与处理 7.1 碳酸型功能性饮料： 取150 mL混匀后的样液于超声波中脱气 10 min后，备用。 7.2 果粒或果汁型功能性饮料：取混匀后的样液， 用1 moL/L氢氧化钠调 pH至6.9～7.1之 间，置离心机中以转速 4000 r/min离心 10 min，取上清液过滤后，备用。 7.3 其他功能性饮料：直接混匀后，备用。 8 分析步骤 8.1 提取 称取已处理过的 试样 50.0 g（精确到 0.001g），于250 mL容量瓶中， 加人 100 mL水， 振摇混匀 ，将其置于超声波清洗器中 ，超声提取约 15 min后，用水定容至刻度后混匀 。（如 样品溶液的 pH在7.0以上，用柠檬酸调节 pH在4.0～6.0之间；如样品溶液的 pH在4.5以 下，则应用磷酸盐缓冲液代替水作为提取液并重复以上提取步骤）。 8.2 富集、净化 准确吸取 20 mL（7.1）提取液上样到已处理过的 维生素 B12免疫亲和净化柱上 ，弃去流 出液，抽干；再用3 mL甲醇进行洗脱， 并收集洗脱液于 10 mL刻度试管中 ；整个过程流速 控制在约1滴/s。于60 ℃~70 ℃水浴中氮气吹干，最后 用1mL初始流动相进行复溶，溶液 过0.22 µm水系滤头，供高效液相色谱 -质谱 /质谱仪测定。 8.3 色谱参考条件 8.3.1 色谱柱： C18（5 mm×150 mm×2.7 µm）反向色谱柱， 或具有同等性能的色谱柱。 8.3.2 流动相：梯度洗脱 见表 1。 表1 梯度洗脱 T/min A（甲醇） % B（10mmoL/L 乙酸铵） % 0.0 2 98 2.0 2 98 6.0 40 60 6.2 100 0 7.0 2 98 15.0 2 98 8.3.3 流速： 300 µL/min。 全国团体标准信息平台 8.3.4 柱温 35℃。 8.3.5 进样量 10µL。 8.4 质谱参考条件 8.4.1 离子源： ESI离子源。 8.4.2 气流量： 11 L/min。 8.4.3 压力： 35 psi。 8.4.4 扫描模式：正离子扫描。 8.4.5 反应模式： MRM。 8.4.6 喷雾电压、碰撞能量等质谱参数应优化至最优灵敏度。 8.4.7 化合物离子参数 见表 2。 表2 化合物离子参数 化合物 定性离子对 m/z 定量离子对 m/z 678.3＞147.2 维生素 B12 678.3＞359.2 678.3＞147.2 8.5 测定 8.5.1 标准曲线的制作 系列标准工作溶液由低到高浓度依次进样检测 ，以峰面积为纵坐标 -浓度为横坐标作图 ， 得到标准曲线回归方程。 8.5.2 试样溶液的测定 待测溶液中待测化合物的响应值应在标准曲线线性范围内 ，浓度超过线性范围的样品则 应稀释后重新进行分析。 8.5.3 空白试验 不称取试样， 按7.1和7.2的步骤做空白试验。 9 结果计算合表述 按式（ 1）计算试样中维生素 B12的含量。 （1） X——试样中维生素 B12的含量， 单位为 µg/Kg。 10001000 23 1mVVVCX 全国团体标准信息平台 V1——提取液体积（ mL）。 V2——分取体积（ mL）。 V3——最终定容体积（ mL）。 m——样品称样量（ g）。 C——曲线中查得的维生素 B12含量（ ng/mL）。 1000——单位换算系数。 计算结果需扣除空白值，测定结果保留两位有效数字。 10 精密度 在重复条件下获得的两次独立测试结果的绝对差