ICS 67.050 CCS X 04 河 北 省 检 验 检 疫 学 会 团 体 标 准 T/HBIQA SN T/HBIQA 0001 —2025 蜂蜜中13硝基咪唑类药物及其代谢物残 留量的测定 液相色谱 -串联质谱法 Determination of 13 nitroimidazoles and metabolites residues in honey Liquid chromatography -tandem mass spectrometry 2026-01-01实施 实施 2025-11-13发布 河北省检验检疫学会 发布 全国团体标准信息平台 T/HBIQA 0001 —2025 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由河北省检验检疫学会提出并归口。 本文件起草单位：石家庄市疾病预防控制中心 、河北医科大学 。 本文件主要起草人：马玲 、连靠奇、王宁、 聂嘉媛、赵伟、 王可、吕蔚、 苏霞、陈佳静。 全国团体标准信息平台 T/HBIQA 0001 —2025 1 蜂蜜中13种硝基咪唑类药物及其代谢物残留量的测定 液相色谱 -串联质谱法 1 范围 本文件规定了 蜂蜜中 13种硝基咪唑类药物及其代谢物残留量检测 的制样和液相色谱 -串联质谱 测 定方法。 本文件适用于 蜂蜜中 4-硝基咪唑、羟基甲硝唑、 2-甲基 -4-硝基咪唑 、羟甲基甲硝咪唑、甲硝唑 、洛 硝达唑、二甲硝咪唑、 塞克硝唑、替硝唑、奥硝唑、羟基异丙硝唑、异丙硝唑、苯酰甲硝唑 13种硝基咪 唑类药物及其代谢物残留量的测定。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 原理 试样中的13种硝基咪唑类药物及代谢物用 0.1%甲酸乙腈溶液提取，提取液经分散固相萃取 净化， 氮吹浓缩后 用甲醇复溶，液相色谱 -串联质谱 仪测定，基质外标法定量。 5 试剂和材料 5.1 试剂 除另有规定外，试剂均为分析纯，水为 GB/T 6682 规定的一级水。 5.1.1 乙腈（CH 3CN）：色谱纯。 5.1.2 甲酸（CH 2O2）：色谱纯。 5.1.3 甲醇（ CH 4O）：色谱纯 。 5.1.4 无水硫酸镁 （MgSO 4）。 5.1.5 氯化钠（NaCl）。 5.2 溶液配制 全国团体标准信息平台 T/HBIQA 0001 —2025 2 5.2.1 0.1%甲酸乙腈溶液：取 200 μL甲酸，用乙腈定容至 200 mL，混匀。 5.3 标准品 4-硝基咪唑、羟基甲硝唑、 2-甲基 -4-硝基咪唑 、羟甲基甲硝咪唑、甲硝唑、洛硝达唑、二甲硝咪唑、 塞克硝唑、替硝唑、奥硝唑、羟基异丙硝唑、异丙硝唑、苯酰甲硝唑 13种硝基咪唑类药物及其代谢物， 纯度均≥98.0%，各化合物基本信息详见附录 A表A.1。 5.4 标准溶液的配制 5.4.1 单一标准储备液 （100 μg/mL ）：分别称取 13种硝基咪唑类药物及其代谢物标准品（ 5.3）10 mg （精确至 0.1 mg）于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解 并定容至刻度， -18 ℃避光可保存 3个月。 5.4.2 混合标准中间液（1 μg/mL）：准确吸取 标准中间液 （5.4.1）各 0.10 mL 于10 mL容量瓶中， 用甲醇定容至刻度 ，4 ℃避光可保存 1个月。 5.4.3 基质空白溶液 ：将蜂蜜阴性空白样品分别按照 8.1和8.2净化处理后得到的溶液。 5.4.4 基质标准工作液：准确量取 混合标准中间液（ 5.4.2），用基质空白溶液 （5.4.3）稀释，配制成 浓度分别为 0.5 μg/L、2 μg/L、10 μg/L、20 μg/L、50 μg/L、100 μg/L 和200 μg/L的系列基质标准工作液， 现用现配 。 5.5 材料 5.5.1 乙二胺 -N-丙基硅烷硅胶（ PSA）：40 µ m~60 µ m 。 5.5.2 微孔尼龙滤膜： 0.22 µ m。 6 仪器和设备 6.1 液相色谱 -串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ ESI）。 6.2 离心机：转速 不低于 10 000 r/min。 6.3 超声波清洗器。 6.4 涡旋振动器。 6.5 氮吹仪。 6.6 天平：感量为 0.01 g和0.000 01 g 。 7 试样的制备与保存 7.1 试样的制备 蜂蜜样品搅拌均匀后置入样品瓶中，密封，并做上标记。 7.2 试样的保存 4 ℃避光保存 。 全国团体标准信息平台 T/HBIQA 0001 —2025 3 8 分析步骤 8.1 提取 称取 1.00 g（精确至 0.01g） 蜂蜜试样于50 mL离心管中， 加 2 mL水， 涡旋混匀 ，再加入 14 mL 0.1% 甲酸乙腈溶液 （ 5.2.1），以2 000 r/min 涡旋振荡 3 min，加入 0.5 g NaCl 涡旋 1 min，于4 ℃下10 000 r/min 离心 5 min。将上清液移出，待净化。 8.2 净化 取10 mL上清液于盛有 0.1 g PSA（5.5.1）和0.4 g无水硫酸镁的 15 mL离心管中，涡旋 1 min，于 4 ℃下10 000 r/min 离心 5 min，移取7 mL上清液至另一离心管中，于 35 ℃下氮吹至近干，加入 1 mL 甲醇复溶， 经0.22 μm尼龙滤膜过滤，供液相色谱 -串联质谱测定 。 8.3 液相色谱 -串联质谱参考条件 8.3.1 参考色谱条件 a) 色谱柱： 五氟苯基柱（ 100 mm×3.0 mm，2.6 µ m）或相当者 ； b) 流动相： A为0.1%甲酸水溶液 ，B为乙腈， 梯度洗脱条件见表 1； c) 流速： 0.3 mL/min； d) 柱温： 40 ℃； e) 进样量： 3 µL。 表1 梯度洗脱条件 时间（min） A（%） B（%） 0.0 80 20 2.5 80 20 2.6 70 30 3.5 70 30 3.6 5 95 5.5 5 95 5.6 80 20 8.0 80 20 8.3.2 参考质谱条件 a) 离子化方式：电喷雾正离子模式（ ESI+）； b) 质谱扫描方式：多反应监测（ MRM）； c) 其他参考质谱条件见附录 A中的表 A.1。 8.4 液相色谱 -串联质谱测定 8.4.1 定性测定 在相同测试条件下， 试样溶液中 硝基咪唑类药物及代谢物 与基质标准溶液中 硝基咪唑类药物及代谢 物的保留时间偏差在 ± 0.1 min之内；且检测到的相对离子丰度，应与浓度相当的 基质标准溶液相对离子 丰度一致 ，其允许偏差为 ± 40%。 全国团体标准信息平台 T/HBIQA 0001 —2025 4 8.4.2 定量测定 按8.3.1和8.3.2设定仪器条件， 取试样溶液和相应的基质标准溶液，作单点或多点校正，外标法定 量。试样溶液中 待测物的响应值应在标准曲线线性范围内；超出线性范围时，可用 基质空白溶液 稀释后 重新进样测定。 在上述色谱 -质谱条件下， 基质标准溶液 中13种硝基咪唑类药物及 其代谢物的特征离子 质量色谱图见附录 B。 8.4.3 空白实验 取空白试样，除不加标准溶液外，采用与试样相同的测定步骤进行平行操作 。 9 结果计算 试样中硝基咪唑类 药物及其代谢物的含量按标准曲线或公 式（ 1）计算： X=A×Cs×V1×1000 As×V2×m×1000 ………………………… .........（1） 式中： X——试样中被测物的含量，单位为微克每千克（ μg/kg）； A——试样溶液中被测物的峰面积； Cs——标准溶液中被测物浓度 的数值，单位为纳克每毫升（ ng/mL）； V1——提取液总 体积的数值，单位为毫升（ mL）； As——标准溶液中被测物的峰面积； V2——用于氮吹的上清液体积， 单位为毫升（ mL）； m——试样质量 的数值，单位为克（ g）。 10 检测方法的灵敏度、准确度和精密度 10.1 灵敏度 本方法对蜂蜜中 13种硝基咪唑类药物 及其代谢物的检出限为 0.5 μg/kg ，定量限为 1.5 μg/kg。 10.2 准确度 本方法对法对蜂蜜中 13种硝基咪唑类药物及 其代谢物在 1.5 µ g/kg~100 .0 µ g/kg添加浓度的回收率 为80%~105% 。 10.3 精密度 本方法相对标准偏差≤ 20%。 全国团体标准信息平台 T/HBIQA 0001 —2025 5 附 录 A （资料性） 参考质谱条件 参考质谱条件1)： a) 毛细管电压： 4000 V； b) 干燥气温度： 325 ℃； c) 干燥气流速：10 L/