ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 314—2025 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体镧系 荧光免疫层析法 Lanthanide fluorescence immunochromatographic assay for detection of antibody against porcine reproductive and respiratory syndrome virus N protein 2025 - 11 - 11发布 2025 - 11 - 11实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 314—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件涉及专利。 本文件由 四川省动物疫病预防控制中心 提出。 本文件由 中国兽医协会 归口。 本文件起草单位： 成都海关技术中心， 成都微瑞生物科技有限公司、 成都市动物疫病预防控制中心、 新疆维吾尔自治区动物卫生监督所（自治区动物疾病预防控制中心）、新疆生产建设兵团畜牧兽医工作 总站。 本文件主要起草人： 杨苗、林华、李桂黎、张毅、章建、岳建国、裴超信、陈瑛琪、李敏、陈涛云、 李岩、张家瑞、吴俊清、邵靓、徐蜜、周潇潇、刘亚涛、古丽曼·木哈买提拜、李舵、加米拉·玉山巴 依、居马别克·夏拉巴依、张旭、李杰、赵化芳、王泽洲 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 314—2025 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时， 可能涉及到条目 5、7、9、10、附录 A和附录 B 相关的专利的使用 。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人姓名： 成都微瑞生物科技有限公司 地址：四川省成都市高新西区 科新路 6号。 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责 任。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 314—2025 1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体镧系荧光免疫层析法 1 范围 本文件规定了猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体 镧系荧光免疫 层析法的原理、试剂与耗材 、仪器 设备、样品准备、 操作步骤、 结果判定及废弃物处理等内容。 本文件适用于 检测猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体 。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 镧系荧光免疫层析技术 Lanthanide fluorescence immunochromatographic assay；LFICA 是以镧系荧光微球作为抗原的示踪物，同时将抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析技术来实现抗 原-抗体特异性免疫反应的一种新型免疫层析技术。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（ Bovine serum albumin ） NC膜：硝酸纤维素膜（ Nitrocellulose membrane ） PRRSV：猪繁殖与呼吸道综合征病毒（ Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus ） PVC：聚氯乙烯塑料材料（ Polyvinyl chloride ） 5 原理 该检测基于双抗原夹心法原理。血清中的猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体与镧系荧光微球标记 的N蛋白抗原结合，形成抗原 -抗体免疫复合物。复合物在层析过程中被 T线包被的 N蛋白抗原捕获并形 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 314—2025 2 成双抗原夹心复合物；未结合的标记物被 C线上的蛋白抗体捕获。镧系荧光层析仪测定 T线和 C线荧光信 号值（ T/C比值），通过标准曲线计算抗体效价。 6 试剂和耗材 6.1 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白，制备方法见附录 A。 6.2 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体检测卡，制备方法见附录 B。 6.3 相关试剂，配制方法见附录 C。 6.4 猪繁殖与呼吸综合征病毒标准阳性血清，制备方法见附录 D。 7 仪器设备 7.1 可调单道移液器 （0.5 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL）。 7.2 注射器（ 5 mL）。 7.3 离心机（最大离心力 15000 r/min）。 7.4 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱， -20 ℃冰箱。 7.5 便携式镧系 荧光分析仪 ，操作方法见附录 E。 7.6 电子天平（精确度为 0.1 g）。 8 样品的采集与保存 8.1 样品的采集与处理 按照 NY/T 541 规定进行样品的采集和处理。无菌注射器静脉采血，不少于 3 mL，用自然析出法分 离血清后，置于无菌血清管中。血清清亮，无溶血，无污染。 8.2 血清样品的保存与运输 按照 NY/T 541 规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存。若超过一周 检测，置于 -20 ℃以下冷冻保存。 9 检测方法 9.1 样品稀释 将待检血清 样品用样品稀释液按 1:50进行稀释。 9.2 加样 取出猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体镧系荧光免疫层析检测卡 ，置于水平和干净的桌面 上， 用移液器吸取 已稀释的待测样品 80 μL，垂直滴加于加样孔内。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 314—2025 3 9.3 检测 避光置于室温作用 15 min后，将检测卡放入便携式镧系 荧光分析仪检测 。分析仪通过 LED灯激发 并收集检测线（ T线）和质控线（ C线）上的荧光信号，分析仪系统软件自带计算功能，将荧光信号值 转换成数值（ T线和 C线），由 T、C荧光信号值转换成样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体检 测值。 10 结果判定 10.1 试验成立条件 当仪器完成读值后，如果检测值显示“无效”，说明仪器未检测到荧光信号。则实验不成立，应重 新检测。 如果检测值显示数值，说明质控线和检测线荧光信号值正常，则实验成立。 10.2 结果判定 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白抗体检测值≥ 32，判为抗体阳性；检测值＜ 32，判为抗体阴性。 11 废弃物处理 采样和检测过程中产生的废弃物按照 GB 19489 的规定执行 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 314—2025 4 附 录 A （资料性） 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白的制备 A.1 目的基因的扩增 pET-32a（+）表达载体及 PMD -18T可购买商品化试剂 。根据 pET-32a（+）表达载体的特点设计两 端含有限制性内 切酶BamH I 、Xho I 酶切位点的引物： 上游为 5'-CGGATCCATGCCAAATAACAACG -3’ 下游为 5'-GCTCGAGTCATGCTGAGGGTGAT -3’ 扩增出目的 片段 N蛋白基因 ，扩增条件： 94 ℃变性 3 min，94 ℃ 45 s，56 ℃复性 90 s，72 ℃延伸 90 s，进行 30个循环，最后 72 ℃延伸 10 min。 A.2 目的基因的克隆和阳性重组子的筛选 PCR扩增产物电泳后切胶回收，与 PMD -18T克隆载体 16 ℃过夜连接后，转化到 DH5α感受态细 胞中，挑取单克隆 37 ℃过夜培养，提取质粒后，以质粒为模板进行 PCR鉴定阳性克隆，送测序。 A.3 N基因融合表达载体的构建 用限制性内切酶 BamH I 、Xho I 分别酶切 T/N和pET-32a（+），1 %琼脂糖电泳切胶回收 N基因 目的片段和 pET-32a（+）双酶切后的大片段，用 T4连接酶将两者 16 ℃过夜连接，连接产物转入 BL21 感受态细胞， LB固体培养基培养 8 h ~ 10 h ，挑取单菌落培养过夜后提取质粒，用 PCR及限制性内切 酶BamH I 、Xho I 双酶切分别鉴定， PCR产物和酶切产物用 1%琼脂糖电泳进行分析， 筛选阳性克隆， 将重组的质粒送出测序。 A.4 pET32a -N基因融合蛋白的诱导表达 筛选出的阳性克隆菌在 LB培养基中摇菌培养过夜后，将过夜菌按照 1:10