ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 313—2025 狂犬病病毒抗体镧系荧光免疫层析法 Lanthanide fluorescence immunochromatographic assay for detection of antibody against rabies virus 2025 - 11 - 11发布 2025 - 11 - 11实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 313—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 四川省动物疫病预防控制中心 提出。 本文件由 中国兽医协会 归口。 本文件起草单位： 四川省动物疫病预防控制中心、成都微瑞生物科技有限公司、成都市动物疫病预 防控制中心、上海市动物疫病预防控制中心 。 本文件主要起草人： 吴宣、李敏、阳爱国、李桂黎、李春、岳建国、陈涛云、周潇潇、侯巍、黄云 川、高露、王建、石湉、邓飞、蔡冬冬、章建、徐蜜、杨显超、王泽洲 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 313—2025 1 狂犬病病毒抗体镧系荧光 免疫层析法 1 范围 本文件规定了狂犬病病毒 抗体镧系荧光免疫 层析法的原理、试剂与耗材 、仪器设备 、样品准备、 操 作步骤、 结果判定及废弃物处理等内容。 本文件适用于 检测犬、猫、狼 的血清中狂犬病病毒 抗体，可用于狂犬病病毒 的免疫抗体筛查、辅助 诊断等。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 镧系荧光免疫层析技术 Lanthanide fluorescence immunochromatographic assay；LFICA 是以镧系荧光微球作为抗原的示踪物，同时将抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析技术来实现抗 原-抗体特异性免疫反应的一种新型免疫层析技术。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（ Bovine serum albumin ） FMDV：口蹄疫病毒（ Foot and mouth disease virus） PVC：聚氯乙烯塑料材料（ Polyvinyl chloride ） RV：狂犬病病毒（ Rabies Virus ） 5 原理 该检测基于双抗原夹心法原理。血清中狂犬病病毒 G蛋白抗体与镧系荧光微球标记的重组抗原结合， 形成抗原 -抗体免疫复合物。 复合物在层析过程中被 T线包被的特异性重组抗原捕获并形成双抗原夹心复 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 313—2025 2 合物；未结合的标记物被 C线上的抗体捕获。镧系荧光层析仪测定 T线和 C线荧光信号值（ T/C比值）， 通过标准曲线计算抗体效价。 6 试剂和耗材 6.1 狂犬病病毒 CVS-11株G蛋白，制备方法见附录 A。 6.2 狂犬病病毒荧光微球抗体检测卡，制备方法见附录 B。 6.3 相关试剂，配制方法见附录 C。 6.4 狂犬病病毒 G蛋白标准阳性血清，制备方法见附录 D。 7 仪器设备 7.1 可调单道移液器 （0.5 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL）。 7.2 注射器（ 5 mL）。 7.3 离心机（最大离心力 15000 r/min ）。 7.4 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱， -20 ℃冰箱。 7.5 便携式镧系 荧光分析仪 ，操作方法见附录 E。 7.6 电子天平（精确度为 0.1 g）。 8 样品的采集与保存 8.1 样品的采集与处理 按照 NY/T 541 规定进行样品的采集和处理。无菌注射器静脉采血，不少于 3 mL，用自然析出法分 离血清后，置于无菌血清管中。血清清亮，无溶血，无污染。 8.2 血清样品的保存与运输 按照 NY/T 541 规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存。若超过一周 检测，置于 -20 ℃以下冷冻保存。 9 检测方法 9.1 样品稀释 将待检血清 样品用样品稀释液按 1:50进行稀释。 9.2 加样 取出狂犬病病毒抗体镧系荧光免疫层析检测卡 ，置于水平和干净的桌面 上，用移液器吸取 稀释的待 测样品 80 μL，垂直滴加于加样孔内。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 313—2025 3 9.3 检测 避光置于室温作用 15 min后，将检测卡放入便携式镧系 荧光分析仪检测 。分析仪通过 LED灯激发 并收集检测线（ T线）和质控线（ C线）上的荧光信号，分析仪系统软件自带计算功能，将荧光信号值 转换成数值（ T线和 C线），由 T、C荧光信号值转换成样品中狂犬病病毒 G蛋白抗体检测值。 10 结果判定 10.1 试验成立条件 当仪器完成读值后，如果检测值显示“无效”，说明仪器未检测到荧光信号。则实验不成立，应重 新检测。 如果检测值显示数值，说明质控线和检测线荧光信号值正常，则实验成立。 10.2 结果判定 当检测值≥ 32，判为狂犬病病毒抗体阳性；当检测值＜ 32，判为狂犬病病毒抗体阴性。 11 废弃物处理 采样和检测过程中产生的废弃物按照 GB 19489 的规定执行 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 313—2025 4 附 录 A （资料性） 狂犬病毒 CVS -11株G蛋白的制备 A.1 基因合成与引物设计 在NCBI的数据库 （https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ）下载狂犬病毒 CVS-11株序列，进行昆虫细胞密 码子优化，合成基因 p-RABV -G。根据合成的 p-RABV -G基因设计一对引物，并分别在上游引物和下 游引物添加 EcoR I 和Hind III限制性酶切位点。 RABV -G-FP：5'-AGGAATTCAAATTCCCCATCTACACC -3'； RABV -G-RP：5'-CCAAGCTTCTAGTGATGGTGATGGTGGTGGACTTCCACGAAGTCTTC -3'。 A.2 目的片段扩增及克隆 以p-RABV -G为模版，进行 PCR扩增。 96 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 s，56 ℃退火 30 s，72 ℃ 延伸 1 min，72 ℃最后延伸 7 min。其中第 2 ~ 4步重复 30个循环。使用凝胶回收试剂盒对 PCR产物进 行回收获得目的基因片段。使用 EcoR I 和Hind III限制性内切酶线性化载体质粒 pFastBac1 -GP67并使 用琼脂糖凝胶回收载体片段。 T4 DNA连接酶连接载体和片段，然后将连接产物转化 DH5α感受态大肠 杆菌。链接体系为：目的片段 6 μL，线性化载体 2 μL，10×T4 ligase buffer 1 μL ，T4 ligase 1 μL 。23 ℃ 反应 1 h。将连接产物转化 DH5α感受态大肠杆菌，涂氨苄抗性的 LB固体平板。挑取平板长出的菌落 至5 mL液体 LB培养基， 37 ℃培养 12 h。然后用菌液 PCR鉴定阳性克隆。将鉴定的阳性克隆通用引 物测序鉴定。 A.3 获得重组杆状病毒 将上述鉴定正确的重组质粒转化 DH10B ac感受态大肠杆菌，涂三抗固体平板（卡那霉素 /庆大霉素 /四环素/IPTG/Bluo -gal）。培养 48 h后挑取白色菌落至 5 mL三抗液体 LB培养 12 h。 用M13F和M13R分别作为上下游引物， 进行菌液 PCR鉴定。 94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 30 s， 56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 3 min，72 ℃最后延伸 7 min。其中第 2 ~ 4步重复 30个循环。 插入片段长度 加上 2300 bp为PCR产物的片段理论大小。若重组不完全，在 300 bp处会有条带。 选取 300 bp处无条带的，重组完全的单克隆菌液提取 Bacmid。将提取的重组 Bacmid转染昆虫细 胞sf9。Sf9细胞于 27 ℃培养 4 d，收获的上清为 P1代毒。 将sf9细胞铺到细胞培养皿，加入 500 μL的P1代毒并摇匀。培养皿放 27 ℃培养箱培养 72 h。培 养过程观察细胞病变现象，病变后的 sf9细胞会变大变圆。需要多铺 1盘sf9细胞作为正常细胞对照。 收获的扩增后