ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 312—2025 O型口蹄疫病毒抗体镧系荧光免疫层析法 Lanthanide fluorescence immunochromatographic assay for detection of antibody against foot and mouth disease virus type O 2025 - 11 - 11发布 2025 - 11 - 11实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 312—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件涉及专利。 本文件由 四川省动物疫病预防控制中心 提出。 本文件由 中国兽医协会 归口。 本文件起草单位： 四川省动物疫病预防控制中心 、成都微瑞生物科技有限公司 、中国农业科学院兰 州兽医研究所 、新疆维吾尔自治区动物卫生监督所（自治区动物疾病预防控制中心） 。 本文件主要起草人： 周明忠、陈斌、常慧云、李春、章健、吴宣、陈涛云、张永光、邵军军、陈弟 诗、阳爱国、徐蜜、裴超信、张毅、李丽、蔡冬冬、刘亚涛、古丽曼·木哈买提拜、李舵、居马别克·夏 拉巴依、任娟、王泽洲 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 312—2025 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时， 可能涉及到条目 5、7、9、10、附录 A和附录 B 相关的专利的使用 。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件下， 就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以下联 系方式获得： 专利持有人姓名： 成都微瑞生物科技有限公司 地址：四川省成都市高新西区 科新路 6号 请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责 任。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 312—2025 1 O型口蹄疫病毒抗体镧系荧光免疫层析法 1 范围 本文件规定了 O型口蹄疫病毒 抗体镧系荧光免疫 层析法的原理、试剂与耗材 、 仪器设备 、 样品准备、 操作步骤、 结果判定及废弃物处理等内容。 本标准适用于检测牛、羊、猪血清中 O型口蹄疫病毒抗体。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3.1 镧系荧光免疫层析技术 Lanthanide fluorescence immunochromatographic assay；LFICA 是以镧系荧光微球作为抗原的示踪物，同时将抗体固定在硝酸纤维素膜上，通过层析技术来实现抗 原-抗体特异性免疫反应的一种新型免疫层析技术。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（ Bovine serum albumin ） FMDV：口蹄疫病毒（ Foot and mouth disease virus） NC膜：硝酸纤维素膜（ Nitrocellulose membrane ） PVC：聚氯乙烯塑料材料（ Polyvinyl chloride ） 5 原理 该检测基于双抗原夹心法原理。血清中的 O型口蹄疫病毒抗体与镧系荧光微球标记的 O型口蹄疫病 毒复合抗原结合，形成抗原 -抗体免疫复合物。复合物在层析过程中被 T线包被的 O型口蹄疫病毒抗体特 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 312—2025 2 异融合抗原捕获并形成双抗原夹心复合物；未结合的标记物被 C线上的 O型口蹄疫病毒阳性血清抗体捕 获。镧系荧光层析仪测定 T线和 C线荧光信号值（ T/C比值），通过标准曲线计算抗体效价。 6 试剂和耗材 6.1 重组口蹄疫病毒 O型多表位抗原，制备方法见附录 A。 6.2 O型口蹄疫病毒荧光微球抗体检测卡，制备方法见附录 B。 6.3 相关试剂，配制方法见附录 C。 6.4 O型口蹄疫病毒标准阳性血清，制备方法见附录 D。 7 仪器设备 7.1 可调单道移液器 （0.5 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL）。 7.2 注射器（ 5 mL）。 7.3 离心机（最大离心力 15000 r/min ）。 7.4 2 ℃ ~ 8 ℃冰箱， -20 ℃冰箱。 7.5 便携式镧系 荧光分析仪 ，操作方法见附录 E。 7.6 电子天平（精确度为 0.1 g）。 8 样品的采集与保存 8.1 样品的采集与处理 按照 NY/T 541 规定进行样品的采集和处理。无菌注射器静脉采血，不少于 3 mL，用自然析出法分 离血清后，置于无菌血清管中。血清清亮，无溶血，无污染。 8.2 血清样品的保存与运输 按照 NY/T 541 规定进行血清样品的存放与运输。血清样品置 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存。若超过一周 检测，置于 -20 ℃以下冷冻保存。 9 检测方法 9.1 样品稀释 将待检血清 样品用样品稀释液按 1:50进行稀释。 9.2 加样 取出O型口蹄疫病毒抗体镧系荧光免疫层析检测卡，置于水平和干净的桌面上，用移液器吸取已 稀释好的检测样品，垂直滴加 80 μL于加样孔内 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 312—2025 3 9.3 检测 避光置于室温作用 15 min后，将检测卡放入便携式镧系 荧光分析仪检测 。分析仪通过 LED灯激发 并收集检测线 （ T线） 和质控线 （ C线） 上的荧光信号， 分析仪将荧光信号值转换成数值 （ T线和 C线） ， 由T、C荧光信号值转换成样品中 O型口蹄疫病毒抗体检测值。 10 结果判定 10.1 试验成立条件 当仪器完成读值后，如果检测值显示“无效”，说明仪器未检测到荧光信号。则实验不成立，应重 新检测。 如果检测值显示数值，说明质控线和检测线荧光信号值正常，则实验成立。 10.2 结果判定 当检测值＜ 8时，判为 O型口蹄疫病毒抗体阴性；当检测值 ≥16时，判为 O型口蹄疫病毒抗体阳 性；当 8≤检测值＜ 16时，判为 O型口蹄疫病毒抗体可疑。 11 废弃物处理 采样和检测过程中产生的废弃物按照 GB 19489 的规定执行 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 312—2025 4 附 录 A （资料性） 重组口蹄疫病毒 O型多表位抗原的制备 A.1 原核重组表达载体的构建 A.1.1 表位融合 DNA设计合成 选用我国 O型口蹄疫病毒代表毒株 O/MYA98/BY/2010 、OS/99、O/SCGH/CHA/2016 、Akesu /58、 O/CHA/7/2011 、O/XJBC/CHA/2017 （GenBank登录号为： JN998085 、KX161429 、AJ131469 、JF837375 、 KY696708 ），将所有表位 DNA通过间隔子（ linker）顺序连接组装成多表位 DNA，将其序列优化为大 肠杆菌偏爱密码子序列，为了保证 DNA正确插入表达载体，在 DNA序列的两端分别引入了特异性酶 切位点， BamH I和Xho I，利用化学合成的方法合成 O型口蹄疫病毒多表位蛋白融合表达目的基因序 列。 A.1.2 重组质粒的构建 用BamH I和Xho I将上述多表位 DNA进行双酶切，反应体系为： rCutSmart 缓冲液 5 μL，BamH I和Xho I各2 μL，DNA 10 μL，37 ℃反应 2 h；采用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化回收目的 DNA，然后 用T4 DNA连接酶将其与 BamH I和Xho I线性化的 pET-32a(+)连接， 即为重组表达质粒 pET-32a-OME。 反应体系为： 10× buffer 1 μL，OME 5 μL，pET-32a(+)片段 1 μL，T4 DNA ligase 1 μL，无离子水 2 μL， 总体积 10 μL；4℃连接过夜。然后将 10 μL连接产物加入解冻的 JM109感受态细胞，再补加 700 μL预 热（ 37 ℃）的 SOC培养液，振荡培养 1 h（220 r/min）。4000 r/min离心 4 min，吸弃部分上清，留 100 μL ~ 200 μL液体重悬细胞，取适量细胞悬液接种 LB固体培养基平板（ Am