ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 311—2025 牛羊精液牛羊猪三种布鲁氏菌三重 实时荧光 PCR检测方法与分离培养方法 Triple real -time PCR methods for detecting brucella genus and isolation protocols for bovine, sheep and pig 's semen 2025 - 10 - 28发布 2025 - 10 - 28实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 311—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本标准由 中国农业大学动物医学院 提出。 本标准由中国兽医协会归口。 本标准起草单位： 中国农业大学 动物医学院 、厦门睿科纳芯科技有限公司、广西壮族自治区动物疫 病预防控制中心。 本标准主要起草人 ：何诚、张学迪、崔跃徽、黄宗洋、王慧敏、陈硕、宋娜杰、熊毅、郑敏。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 311—2025 1 牛羊精液牛羊猪三种布鲁氏菌三重实时荧光 PCR检测方法与分离培 养方法 1 范围 本文件规定了 牛羊精液中牛种、 羊种和猪种布鲁氏菌三重实时定量 PCR检测方法和分离培养方法所 包括的试剂和材料、仪器设备、样品采集与处理、操作方法、结果判定和 分离培养 。 本文件适用于 牛羊精液中牛种、羊种和猪种布鲁氏菌 的核酸检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18646 -2025 动物布鲁氏菌病诊断技术 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BHQ：黑洞淬灭基团（ Black Hole Quencher） BSL-3：生物安全防护三级实验室 （Biosafety Level 3 ） Ct：循环阈值（ Cycle Threshold） Cy5：花青染料（ Cyanine Dyes） DEPC：焦碳酸二乙酯（ Diethyl pyrocarbonate ） DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic Acid ） FAM：6-羧基荧光素（ 6-Carboxyfluorescein ） HEX：六氯 -6-甲基荧光素（ 6-Hexachlorofluorescein ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffered Saline） PCR：聚合酶链式反应（ Polymerase Chain Reaction） RNA：核糖核苷酸（ Ribonucleic Acid） ROX：6-羧基 -X-罗丹明（ 6-Carboxy -X-rhodamine ） 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 311—2025 2 5 试剂和耗材 5.1 试剂 5.1.1 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，所用水应符合 GB/T 6682 中二级水的要求，所 有试剂均用无 RNA 酶的容器分装。 5.1.2 提取核酸可使用商品化核酸提取试剂盒。 5.1.3 DEPC 水：按照附录 A 中 A.1 配制。 5.1.4 0.01 mol/L PBS 溶液（ pH 7.4）：按照 A.2 配制。 5.1.5 商品化荧光 PCR 试剂盒：含荧光 PCR 反应混合液 、DNA聚合酶等。 5.1.6 阳性对照 ：重组质粒，制备过程 按附录 B。 5.1.7 阴性对照 ：无菌水 。 5.1.8 内标溶液：用于过程质量控制的重组质粒， 制备过程 按附录 B。 5.2 引物和探针 三重荧光 PCR 扩增用上、下游引物和探针序列 按附录 C。 6 仪器与设备 6.1 多通道（四通道）荧光 PCR仪。 6.2 高速台式冷冻离心机，可控温至 4 ℃，离心力可达 12000 g 以上。 6.3 涡旋振荡仪。 6.4 微量移液器，量程为 0.5 µ L ~ 10 µ L 、2 µ L ~ 20 µ L 、20 µ L ~ 200 µ L 和200 µ L ~ 1 000 µ L 。 6.5 冰箱，储藏温度在 2 ℃ ~ 8 ℃ 和 − 20 ℃ 以下。 7 样品的采集与处理 7.1 总则 样品的采集、保存与运输按照 NY/T 541 执行。生物安全要求按照 GB 19489 的规定。 7.2 样品采集 7.2.1 新鲜样本 精液样品最好用假阴道挤压阴茎或人工刺激的方法采集。 精液样品精子含量要多， 不要加入防腐剂， 且应避免抗菌冲洗液 的污染。 7.2.2 冷冻精液样本 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 311—2025 3 用洁净的 剪刀或其他物品 ， 剪开冷冻精液塑料管两头 （每剪开 1管冷冻精液需进行消毒并擦拭剪刀） ， 后用洁净的枪头吹出冷冻精液到洁净的离心管中 。 8 操作方法 8.1 精液核酸提取 采用柱式核酸提取试剂盒或用自动化核酸提取仪提取各类样品中的精液核酸 DNA。对待检样本进 行（ 65±2℃，60 min）灭活处理后，按照商品化 DNA提取试剂盒说明书操作进行核酸提取。核酸提取 前需在样本中加入定量的内标溶液后再进行核酸提取。如果 2 h 内检测可将提取的核酸置于冰上保存， 超过 2 h 应置于 − 80 ℃ 冰箱保存 。 8.2 扩增试剂的配制 设实时荧光 PCR 反应管数为 n，n为待检样品数 、阳性管数 及阴性管数 之和，每个反应的体系 按 附录 D配制，依次加入体系中的成分 ，为了避免移液器取样损失，建议按 n + 1 个反应进行配制。配 制反应液在冰盒上进行。将配制的荧光 PCR 反应液充分混匀，按照每管 20 µ L 分装于 0.2 mL 透明 PCR 管内，将 PCR 管置于 96 孔板上，按顺序加样。 8.3 加样 在上述 8.2 的反应管中分别加入 8.1 中提取的核酸 DNA 5 µ L，使每管总体积达到 25 µL，记录 反应管对应的样品编号。 同时设阴性对照、 阳性对照， 阳性对照为标准菌株 DNA， 阴性对照为不含 DNA 的反应体系。 盖紧管盖后， 500 g 离心 15 s。 8.4 荧光PCR反应 将 8.3 中加样后的反应管放入荧光 PCR 检测仪中，设置探针：报告基团选择 Cy5、ROX、FAM 和HEX 4个荧光通道， Cy5 对应内标 （用于对核酸提取过程及 PCR 扩增过程进行监控，可减少假阴 性结果的出现） ；ROX 对应牛种； FAM 对应羊种； HEX 对应猪种 ，在荧光 PCR 检测仪内进行反应 。 反应条件如下 ：95 ℃ 2 min ；95 ℃ 15 s ，60 ℃ 30 s （在每个循环退火时收集荧光信号，共 40个循环）。 9 结果判定 9.1 结果分析条件设定 读取检测结果，阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为基准。不同仪器 可根据仪器噪声情况进行调整。 9.2 试验成立的条件 9.2.1 阴性对照： ROX、FAM、HEX 通道均无 Ct 值，且无 明显扩增曲线， Cy5通道 Ct 值＜ 40。 9.2.2 阳性对照：所有通道 Ct值均＜ 38，且有明显扩增曲线。 9.2.3 9.2.1 和 9.2.2 要求需在同一次试验中同时满足，否则，本次试验无效，需重新进行 。 9.3 结果描述及判定 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 311—2025 4 9.3.1 结果描述 Cy5 通道阳性荧光信号表示内标阳性； ROX 通道阳性荧光信号表示牛种 布鲁氏菌 核酸阳性； FAM 通道阳性荧光信号表示羊种 布鲁氏菌 核酸阳性； HEX 通道阳性荧光信号表示猪种 布鲁氏菌 核酸阳性。 只有一种阳性荧光信号为单阳性；两种阳性荧光信号表示对应的其中两种种属核酸阳性，为双阳性；三 种阳性荧光信号表示三种种属核酸阳性，为三阳性。 首先按照表 1判定各荧光通道的阳性和阴性结果， 然后根据各荧光通道阳性和阴性结果的组合判定样本的检测结果。 表 1 各荧光通道 Ct值和阴性、阳性结果判读 荧光通道 Ct值 各荧光通道阴性、阳性判定结果 Cy5（内标） 无Ct值显示 阴性结果 Ct值<40