ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 309—2025 非洲猪瘟病毒检测纳米抗体夹心 ELISA方 法 Detection of African swine fever virus by double nanobody based sandwich ELISA 2025 - 10 - 28发布 2025 - 10 - 28实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 309—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国农业科学院兰州兽医研究所 提出。 本文件由 中国兽医协会 归口。 本文件起草单位： 中国农业科学院兰州兽医研究所 、兰州兽研生物科技有限公司、 湖南省动物疫病 预防控制中心 。 本文件主要起草人： 杨吉飞、牛庆丽、 兰喜、刘永杰、马维民、李昕、 林密、蒋韬、 唐小明、赵亚 茹、刘志杰、刘光远、关贵全、罗建勋、殷宏 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 309—2025 1 非洲猪瘟病毒检测纳米抗体夹心 ELISA方法 1 范围 本文件规定了 检测非洲猪瘟病毒 的纳米抗体夹心 ELISA方法，包括试验原理、 试剂、仪器设备 及耗 材、操作步骤和 废弃物处理 。 本文件适用于 非洲猪瘟 病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18648 非洲猪瘟诊断技术 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASF：非洲猪瘟（ African Swine Fever ） ASFV：非洲猪瘟病毒（ African Swine Fever Virus ） BSA：牛血清白蛋白（ Bovine Serum Albumin ） ELISA：酶联免疫吸附试验（ Enzyme Linked Immunosorbent Assay ） HRP：辣根过氧化物酶（ Horseradish Peroxidase ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate Buffer Saline ） SDAL：抗 ASFV p30 蛋白纳米抗体 SDAL（Nanobody SDAL against ASFV p30 protein ） SDAZ：抗 ASFV p30 蛋白纳米抗体 SDAZ（Nanobody SDAZ against ASFV p30 protein ） 5 原理 采用双抗体夹心 ELISA反应原理，酶标板上包被抗 ASFV p30 蛋白的纳米抗体 SDAL，捕获待检样品 中的 ASFV抗原，加入辣根过氧化物酶（ HRP）标记的抗 ASFV p30 蛋白的纳米抗体 SDAZ进行孵育。当 样品中存在 ASFV抗原，形成“包被抗体 -抗原 -酶标抗体”复合物，酶标抗体 SDAZ上连接的 HRP催化显 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 309—2025 2 色反应；当样品中无 ASFV抗原，则不能被纳米抗体 SDAL捕获，也不能与酶标抗体 SDAZ结合，加入底 物后不显色；根据样品检测的吸光度，可以定性判定样品中是否有非洲猪瘟病毒抗原。 6 试剂 6.1 抗ASFV p30 蛋白纳米抗体 SDAL，制备方法 见附录 A。 6.2 抗ASFV p30 蛋白纳米抗体 SDAZ，制备方法 见附录 B。 6.3 HRP标记抗 ASFV p30 蛋白纳米抗体 SDAZ，制备方法 见附录 C。 6.4 阳性对照，见附录 D.1。 6.5 阴性对照，见附录 D.2。 6.6 包被缓冲液，见附录 E.1。 6.7 封闭液，见附录 E.2。 6.8 稀释液，见附录 E.3。 6.9 25×浓缩洗涤液，见附录 E.4。 6.10 TMB底物溶液 。 6.11 终止液，见附录 E.5。 7 仪器设备 及耗材 7.1 分析天平（精确度： 0.0001 g）。 7.2 37 ℃温箱。 7.3 2 ℃ ~ 8 ℃ 冰箱， -20 ℃冰箱。 7.4 离心机。 7.5 单道微量移液器（ 0.5 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL 、20 μL ~ 200 μL 、100 μL ~ 1 mL ）。 7.6 多道移液器（ 300 μL）。 7.7 1.5 mL尖底离心管。 7.8 酶标测定仪。 7.9 酶标板。 7.10 封板膜。 7.11 BSL-II级生物安全柜。 8 样品采集、运输与保存 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 309—2025 3 样品采集按照 NY/T 541 规定进行。无菌采集 抗凝血不少于 5 mL。若在 1周内检测，可置 2 ℃ ~ 8 ℃ 条件下保存 ；若超过 1周检测，应置于 -20 ℃以下冷冻保存。组织样品应在 48 h以内检测 ；若超过 48 h， 应置于 -20 ℃以下冷冻保存，且避免反复冻融。 样品的运输与保存按照 NY/T 541 规定执行。 9 检测操作步骤 9.1 样品处理 血液样品反复冻融 3次，检测时无需稀释。 组织样品用生理盐水按照 1:10倍稀释（ 1 g组织加 10 mL 生理盐水），用组织研磨器或其他工具将组织研磨混匀， 3000 r /min离心 5 min，取上清进行检测。 检测 前样品处理应在 BSL-II级生物安全柜中操作，处理过程应符合生物安全 管理规定。 9.2 配置洗涤液 将25×浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水 25倍稀释至工作浓度备用。 9.3 包被 用包被缓冲液将抗 ASFV p30 蛋白纳米抗体 SDAL稀释至 1 μg/mL，加入 96孔酶标板上， 100 μL/孔， 置室温孵育过夜（ 12 h）。 9.4 洗涤 弃去液体，每孔加 300 μL洗涤液洗板 3次，弃去残液，置于吸水纸上拍干。 9.5 封闭 每孔加 200 μL封闭液，置 37 ℃条件下孵育 1 h；洗涤 1次后，置于吸水纸上拍干。 9.6 加待检样本和对照样本孵育 分别在对应的检测孔中加入待检样品 100 µ L。 同时设置阳性对照和阴性对照各 2孔， 每孔加入 100 µ L。 封板膜封板， 37 ℃条件下孵育 30 min。 9.7 洗涤 弃去液体，每孔加 300 μL洗涤液洗板 3次，弃去残液，置于吸水纸上拍干。 9.8 加酶标记抗体孵育 用稀释液将 HRP标记抗 ASFV p30 蛋白纳米抗体 SDAZ稀释至 1 μg/mL，每孔加入 100 μL，封板 膜封板， 37 ℃条件下孵育 30 min。 9.9 洗涤 弃去液体，每孔加 300 μL洗涤液洗板 3次，弃去残液，置于吸水纸上拍干。 9.10 加底物显色 每孔加入 100 μL TMB 底物溶液，封口膜封口，轻微振荡混匀，置 37 ℃条件下避光孵育 10 min。 9.11 终止显色 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 309—2025 4 每孔加入100 μL终止液，轻微振荡混匀， 15 min内测定结果。 9.12 读值 将96孔酶标反应板置于酶标仪中，在 450nm处测量和记录各样品和对照 样品的吸光值。 10 结果判定 10.1 试验成立条件 阴性对照重复测定孔的平均 OD 450nm＜0.2， 阳性对照重复测定孔的平均 OD 450nm≥1.0时， 试验成立。 否则，结果无效，需重新试验。 10.2 结果判定 10.2.1 阳性 若样品 OD 450nm≥0.3时，判定为非洲猪瘟病毒抗原阳性 。 10.2.2 阴性 若样品 OD 450nm＜0.2时，判定为非洲猪瘟病毒抗原阴性。 10.2.3 可疑 若样品 0.2≤OD 450nm＜0.3时，判定为可疑，建议重测。若检测结果仍为可疑，建议用其他方法进一 步检测。 11 废弃物处理 采样和检测过程中产生的废弃物按照 GB 19489 的规定执行 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台