ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 308—2025 非洲猪瘟病毒抗体检测化学发光免疫分析 方法 Chemiluminescent immunoassay for detection of antibody against African swine fever virus 2025 - 10 - 28发布 2025 - 10 - 28实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 308—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国农业科学院兰州兽医研究所 提出。 本文件由 中国兽医协会 归口。 本文件起草单位： 中国农业科学院兰州兽医研究所 、兰州兽研生物科技有限公司、 湖南省动物疫病 预防控制中心 。 本文件主要起草人： 杨吉飞、 敬梦瑶、包艳芳、吕律、牛庆丽 、刘永杰、何莉、 林密、蒋韬 、唐小 明、刘光远、关贵全、 刘志杰、罗建勋、殷宏 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 308—2025 1 非洲猪瘟病毒抗体检测化学发光免疫分析方法 1 范围 本文件规定了非洲猪瘟病毒 抗体检测化学发光免疫分析方法 ，包括试验原理、 试剂、仪器设备 及耗 材、操作步骤和 废弃物处理 。 本文件适用于非洲猪瘟病毒 抗体的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 18648 非洲猪瘟诊断技术 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ASF：非洲猪瘟 （African swine fever） ASFV：非洲猪瘟病毒（ African swine fever virus） BSA：牛血清白蛋白（ Bovine serum albumin） CLIA：化学发光免疫分析 （Chemiluminescence immunoassay ） HRP：辣根过氧化物酶（ Horseradish Peroxidase ） NBSJ：抗ASFV p 72蛋白抗体 NBSJ（Nanobody NBSJ against ASFV p72 protein ） PBS：磷酸盐缓冲液（ Phosphate buffer saline） 5 原理 采用竞争原理，在酶标板上包被 ASFV p72 抗原，加入待检血清孵育，加入辣根过氧化物酶（ HRP） 标记的抗 ASFV p72 蛋白的抗体 NBSJ孵育。 当待检血清样本中存在 ASFV抗体， 则阻断了酶标记抗体 NBSJ 与酶标板中抗原的结合，加入底物后不显色；当待检样本中无 ASFV抗体，酶标记抗体 NBSJ能够与酶标 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 308—2025 2 板上的抗原结合，加入底物后， HRP催化底物显色；根据读取样品的化学发光值，可以定性判定样本中 是否有非洲猪瘟病毒抗体。 6 试剂 6.1 ASFV p72 抗原，制备方法见附录 A。 6.2 抗ASFV p72 蛋白抗体 NBSJ，制备方法见附录 B。 6.3 HRP标记抗 ASFV p72 蛋白抗体 NBSJ，制备方法见附录 C。 6.4 阳性对照，见附录 D.1。 6.5 阴性对照，见附录 D.2。 6.6 包被缓冲液，见附录 E.1。 6.7 封闭液，见附录 E.2。 6.8 稀释液，见附录 E.3。 6.9 25×浓缩洗涤液，见附录 E.4。 6.10 化学发光底物。 7 仪器设备 及耗材 7.1 分析天平（精确度： 0.0001 g）。 7.2 37 ℃温箱。 7.3 2 ℃ ~ 8 ℃ 冰箱， -20 ℃冰箱。 7.4 离心机。 7.5 单道微量移液器（ 0.5 μL ~ 10 μL、10 μL ~ 100 μL 、20 μL ~ 200 μL 、100 μL ~ 1 mL）。 7.6 多道移液器（ 300 μL）。 7.7 1.5 mL尖底离心管。 7.8 化学发光免疫分析仪。 7.9 化学发光板。 7.10 封板膜。 8 样品采集、运输与保存 样品采集按照 NY/T 541 规定进行。无菌采集猪全血不少于 5 mL，分离血清并置于无菌血清管中。 若在 1周内检测，可置 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存；若超过 1周检测，应置于 -20 ℃以下冷冻保存。 样品的运输与保存按照 NY/T 541 规定执行。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 308—2025 3 9 检测操作步骤 9.1 配置洗涤液 将25×浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水 25倍稀释至工作浓度备用。 9.2 包被 用包被缓冲液将 ASFV p72 抗原稀释至 2 μg/mL，加入化学发光反应板， 100 μL/孔，置于 4 ℃条件下 孵育过夜（ 12 h）。 9.3 洗涤 弃去液体，每孔加 300 μL洗涤液洗板 3次，弃去残液，置于吸水纸上拍干。 9.4 封闭 每孔加 200 μL封闭液，置 37 ℃条件下孵育 1 h；洗涤 1次后，置于吸水纸上拍干。 9.5 加待检样本和对照样本孵育 使用稀释液将待检样本和阴阳性对照样本按照 1:1的比例（ 50 µ L稀释液 +50 µ L样本）进行稀释，分 别在对应的检测孔中加入稀释的样本 100 µ L，同时设置阳性对照和阴性对照各 2孔，每孔加入对照样本 100 µ L。封板膜封板， 37 ℃条件下孵育 45 min。 9.6 洗涤 弃去液体，每孔加 300 μL洗涤液洗板 6次，弃去残液，置于吸水纸上拍干。 9.7 加酶标记抗体 孵育 用稀释液将 HRP标记抗 ASFV p72 蛋白抗体 NBSJ稀释至工作浓度，每孔加入 100 μL，封板膜封 板， 37 ℃条件下孵育 30 min。 9.8 洗涤 弃去液体，每孔加 300 μL洗涤液洗板 6次，弃去残液，置于吸水纸上拍干。 9.9 加底物显色 每孔加入 100 μL 化学发光底物 ，封口膜封口， 室温避光孵育 5 min。 9.10 读值 将化学发光板置于化学发光免疫分析仪中，读取各样品和对照样品的化学发光值。 10 结果判定 10.1 结果计算 结果计算以样本的阻断率（ PI）为标准，即 PI =（1-检测样本的 CLIA值/阴性对照平均 CLIA值） × 100%。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 308—2025 4 10.2 试验成立条件 阴性对照化学发光值与阳性对照化学发光值的比值 ≥10， 试验成立。 否则， 结果无效， 需重新试验。 10.3 结果判定 10.3.1 阳性 若样本 PI值≥30 %时，判定为非洲猪瘟病毒抗体阳性 。 10.3.2 阴性 若样本 PI值＜30 %时，判定为非洲猪瘟病毒 抗体阴性。 11 废弃物处理 采样和检测过程中产生的废弃物按照 GB 19489 的规定执行 。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台