ICS 13.040.20 CCS Z04 CSF 中华人民共和国国家标准 团体标准 T/CSF—0123-2025 落叶松对落叶松新壳梭孢抗性 室内检测技术规程 Technical specification for indoor detection of Larix spp. resistance to Neofusicoccum laricinum 中 国 林 学 会 发布 2025-10-28发布 2025-10-28实施 全国团体标准信息平台 ` 全国团体标准信息平台 T/CSF—0123-2025 I 目次 前 言 ................................ ................................ ............... II 1 范围 ................................ ................................ .................... 1 2 规范性引用文件 ................................ ................................ ........... 1 3 术语和定义 ................................ ................................ ............... 1 4 落叶松人工接种落叶松新壳梭孢 ................................ ............................. 2 5 病情调查与分级 ................................ ................................ ........... 3 6 发病枝条中落叶松新壳梭孢定量 ................................ ............................. 3 7 抗性评价 ................................ ................................ ................. 4 附录 A （规范性） 落叶松枯梢病症状及发生规律 ................................ .......... 5 附录 B （规范性） 落叶松室内人工接种枝条病害分级记录表 ................................ 6 附录 C （规范性） 落叶松新壳梭孢分子鉴定 ................................ .............. 7 附录 D （规范性） 荧光定量反应体系及反应条件 ................................ .......... 8 附录 E （规范性） 落叶松抗性检测分级标准和记录表 ................................ ...... 9 全国团体标准信息平台 T/CSF—0123-2025 II 前言 本文件的某些内容可能涉及专利。本文件发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由中国林学会提出并 归口。 本文件起草单位： 东北林业大学 、国家林业和草原局生物灾害防控中心、 中国林业科学研究院森 林生态环境与自然保护研究所 、北京林业大学、南京林业大学、吉林省林业科学研究院和黑龙江省林 业科学院。 本文件主要起草人： 王峰、张瑞芝、戴文昊、张爽、王小艺、梁英梅、谈家金、宋丽文和邓勋 。 全国团体标准信息平台 T/CSF—0123-2025 1 落叶松对落叶松新壳梭孢抗性 室内检测 技术规程 1 范围 本标准规定了落叶松对落叶松新壳梭孢 抗性室内检测技术 规程的范围、规范性引用文件、 术语和 定义、落叶松人工接种落叶松新壳梭孢、病情调查与分级、发病枝条中落叶松新壳梭孢定量和评价标 准。 本标准适用于不同品种、品系、无性系的落叶松，包括但不局限于：日本落叶松 Larix kaempferi (Lamb.) Carr. 、长白落叶松 L. olgensis A. Henry 、兴安落叶松 L. gmelinii (Rupr.) Kuzen. 、华北落叶松 L. principis -rupprechtii (Mayr) Pilger 和杂交种落叶松对落叶松新壳梭孢 Neofusicoccum laricinum (Sawada) Hattori & C. Nakash. 的抗性检测。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件 。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 落叶松新壳梭孢 Neofusicoccum laricinum (Sawada) Hattori & C. Nakash. 落叶松新壳梭孢，隶属于子囊菌门 Ascomycota 、盘菌亚门 Pezizomycotina 、座囊菌纲 Dothideomycetes 、葡萄座腔菌目 Botryosphaeriales 、葡萄座腔菌科 Botryosphaeriaceae 、新壳梭孢属 Neofusicoccum 。 3.2 落叶松枯梢病 Larch shoot blight 落叶松枯梢病是由落叶松新壳梭孢引起、发生在落叶松林的检疫性病害。症状和发生规律见附录 A。 3.3 品种 Cultivar 在一定的生态和经济条件下，经自然或人工选择形成的 植物群体 。 3.4 全国团体标准信息平台 T/CSF—0123-2025 2 品系 Strain 源于同一祖先、与原品种或亲本性状有一定差别，但尚未正式鉴定命名为品种的过渡性变异类型。 3.5 室内人工接种 Indoor artificial inoculation 人为将落叶松新壳梭孢接种到参鉴材料的 当年生尚未木质化的 离体新枝 上，通过参鉴材料的受害 情况检测其对落叶松新壳梭孢的抗性水平。 3.6 病情指数 Disease index （DI） 通过对病害分级后的 落叶松新梢 进行统计， 结合各级病株数量及对应级值权重计算出 反映病情严 重程度的数值 。 3.7 相对抗病指数 Relative resistance index （RRI） 相对抗病指数是通过比较不同单株受落叶松新壳梭孢侵染后 与感病品种对照来衡量植物对病害抵 抗能力的指标 。 3.8 树体内落叶松新壳梭孢 DNA相对量 Relative amount of DNA of N. laricinum in larch 落叶松与落叶松新壳梭孢互作过程中，落叶松新壳梭孢 ITS扩增子的定量循环（ CqNL）与落叶松 ITS扩增子的定量循环（ CqLarix）的相对差异（ 2-∆Cq）。 4 落叶松人工接种落叶松新壳梭孢 4.1 参鉴材料准备 以健康落叶松 离体 2年生枝条 作为参鉴材料，每品系随机选取 3个单株，且从每个单株上截取 3个含 尚未木质化新梢的 2年生落叶松 用于检测。 4.2 接种落叶松新壳梭孢 取2年生落叶松枝条， 75%乙醇表面 消毒 30 s，无菌水冲洗 3次。在尚未木质化的 新梢上，用刀片处 理出微伤口， 处理组接种 0.5 cm × 0.5 cm 的PDA平板培养 5 d的落叶松新壳梭孢菌落边缘菌饼 ，用无菌 脱脂棉缠绕菌饼使其固定在伤口处，并向脱脂棉滴加 100 μL的无菌水保湿。 对照组不接种菌饼，仅以 浸有无菌水的脱脂棉缠绕 。 4.3 接种后管理 将处理好的 试验组和对照组 放入含有 50 mL无菌水的锥形瓶中， 置于25℃的温室（ 16 h光照， 8 h 黑暗；相对湿度： 80%~90%）内培养 ，每隔 1 d更换锥形瓶中的水 。 全国团体标准信息平台 T/CSF—0123-2025 3 5 病情调查与分级 5.1 调查时间 接种后 15 d内，每日定时 记录落叶松的 症状，记录每个枝条的发病时间， 并在接种后第 15 d记录发 病株数和发病症状。 5.2 调查方法 观察接种枝条的病斑以及针叶脱落情况， 统计不同发病级别枝条数量，计算 病情指数和 相对抗病 指数。记录表见附 录B。 5.3 病情分级 病害分级标准 Disease grade 根据病害严重程度和发生情况 ，分级标准如下： 0：枝条健康； Ⅰ：枝条茎部褪绿，少量针叶脱落； Ⅱ：枝条茎部黄褐色，半数针叶脱落，梢头略微下垂； Ⅲ：枝条茎部褐色，大部分针叶脱落，梢头下垂； Ⅳ：枝条茎部呈黑褐色，梢头下垂，除梢头一丛紫灰色枯死针叶外其余针叶全部脱落。 6 发病枝条中落叶松新壳梭孢定量 6.1 接种后病原菌的分离与纯化 于接种后发病枝条的 病、健交界处截取 1 cm枝条进行组织分离。样本经水冲洗去除表面杂质后， 依次使用无菌水 浸泡清洗 3次、 75%乙醇表面 消毒 30 s、无菌水冲洗 3次后转入 3%次氯酸钠消毒 5 min， 最终经 6次无菌水冲洗 后，用无菌滤纸吸干表面水分 ，置于 PDA培养基中， 28℃恒温培