ICS 11.220 CCS B 41 团体标准 T/CVMA 288—2025 布鲁氏菌间接酶标补体 C1q结合试验 （iEL-CFA）抗体检测方法 The method of indirect enzyme labeled complement C1q fixation assay （iEL-CFA） for Brucella antibody detec tion 2025 - 9 - 30发布 2025 - 9 - 30实施 中国兽医协会 发布 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 中国兽医协会 CVMA全国团体标准信息平台 T/CVMA 288—2025 I 前 言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由 中国兽医协会 提出并归口。 本文件起草单位： 广东君睿生物技术研究有限公司、中国动物疫病预防控制中心、河南省动物疫病 预防控制中心、 新疆维吾尔自治区 动物卫生 监督所、新疆哈密市动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区 呼伦贝尔市动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区锡林郭勒盟动物疫病预防控制中心、内蒙古自治区呼 和浩特市动物疫病预防控制中心、博威 (南京 ) 生命科学技术有限公司、北京三元集团畜牧兽医总站。 本文件主要起草人： 毛开荣、梁小杰、何静、孙雨、闫若潜、古丽曼·木哈买 提拜、马春江、刘桂 林、王冠玉、哈达、李志、郭志刚、张春起、梁春菲、莫永熙、蓝婷、孙航、王胜华、谢彩华、颜成旭、 杨帆、格根塔娜、牧兰、李晓艳、龙颖弘。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 288—2025 II 引 言 本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时， 附录 D.1“补体 C1q抗体的制备 ”可能涉及到 1 条“一种用纯化天然补体 C1q制备补体 C1q多克隆抗体的方法” 相关的专利的使用 。 本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。 该专利持有人已向本文件的发布机构承诺，他愿意同任何申请人在合理且无歧视的条款和条件 下，就专利授权许可进行谈判。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可以通过以 下联系方式获得： 专利持有人姓名：广东君睿生物技术研究有限公司（黄剑华、毛开荣、梁小杰、何静、庞春莲、李 梦滢、蓝婷、梁春菲、莫永熙、王庆福） 地址：广东省中山市火炬开发区欧亚路 12号 请注意除上述专利外， 本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责 任。 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 288—2025 1 布鲁氏菌间接酶标补体 C1q结合试验（ iEL-CFA）抗体检测方法 1 范围 本标准规定了布鲁氏菌间接酶标补体 C1q结合试验（ iEL-CFA）抗体检测技术方法，包括原理、试 剂与耗材、仪器设备、操作步骤、结果计算、试验成立条件及结果判定等内容。 本标准适用于羊、牛、猪等布鲁氏菌易感动物血清中布鲁氏菌抗体检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 NY/T 541 兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 BSA：牛血清白蛋白（ Bovine serum albumin ） HRP：辣根过氧化物酶（ Horseradish peroxidase ） iEL-CFA：间接酶标补体 C1q结合试验（ indirect nzyme abeled complement C1q fixation assay） OD：光密度（ optical density ） PBS：磷酸盐缓冲液 （Phosphate buffer saline ） TMB：四甲基联苯胺（ Tetramethylbenzidine ） 5 原理 本方法的原理是：由于补体 C1q参与的抗原抗体反应具有高特异性，当布鲁氏菌抗原与抗体特异性 结合后，能进一步结合补体成分中的 C1q，通过酶标补体 C1q多克隆抗体及酶显色系统可对抗原抗体与 补体C1q的特异性反应结果进行放大显示，从而提高检测的敏感性。 6 试剂和耗材 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 288—2025 2 6.1 试剂 6.1.1 除特别说明以外，本文件所用试剂均为分析纯，试验用水符合 GB/T 6682 中二级水的要求。 6.1.2 布鲁氏菌 LPS抗原，制备方法见附录 A。 6.1.3 布鲁氏菌阳性对照血清，制备方法见附录 B中B.1。 6.1.4 布鲁氏菌阴性对照血清，制备方法见附录 B.2。 6.1.5 补体 C1q抗体，制备方法见附录 D.1。 6.1.6 HRP标记补体 C1q抗体，制备方法见附录 D.2。 6.1.7 布鲁氏菌 LPS抗原包被板 ,制备方法见附录 E.1。 6.1.8 样品稀释液，制备方法见附录 E.2。 6.1.9 20倍浓缩洗涤液，制备方法见附录 E.3。 6.1.10 TMB显色液，制备方法见附录 E.4。 6.1.11 终止液，制备方法见附录 E.5。 6.2 耗材 6.2.1 离心管（ 2.0 mL，无核酸酶） 。 6.2.2 微量移液器吸头 （10 μL、200 μL、1000 μL，无核酸酶） 。 6.2.3 血清稀释板（ 96孔一次性 U型血凝板或 96孔细胞培养板）。 6.2.4 一次性注射器或采血管（ 5 mL、10 mL）。 7 仪器设备 7.1 冰箱： 2 ℃ ~ 8℃，-20 ℃以下。 7.2 低速离心机。 7.3 恒温培养箱。 7.4 振荡器。 7.5 酶标检测仪。 7.6 微量移液器 （量程为 2 µL ~ 20 µ L、20 µ L ~ 200 µ L和200 µ L ~ 1000 µ L）。 7.7 多道移液器（ 量程为 30 µL ~ 300 µL）。 8 样品的采集与处理 8.1 基本要求 中国兽医协会 CVMA 全国团体标准信息平台 T/CVMA 288—2025 3 血液样品采集与处理的信息应记录完整，确保可追溯性。主要信息应包括：动物种类、来源地、免 疫状况、是否流行区域，样品处理地点等。 8.2 样品的采集 应按照 NY/T 541 中的规定进行动物血液样品采集。按常规方法用干燥、洁净、无菌的离心管或适 当容器，采集血液不少于 2 mL。 8.3 样品的处理 按照动物病原微生物分类目录中有关布鲁氏菌的相关操作要求， 对疑似布鲁氏菌感染动物血液样品 的处理，须在 Ⅱ级生物安全柜中进行，处理方法可采用除菌过滤或加入 0.3 %的Proclin -300等灭菌。未经 除菌或灭菌处理的疑似布鲁氏菌感染动物血清样品的检测操作，必须在 Ⅱ级生物安全柜中进行。 8.4 样品的贮存与运送 按照 NY/T 541中规定进行动物血清或全血样品的存放与运输。血清样品若在一周内检测，可置 2 ℃ ~ 8 ℃条件下保存。若超过一周再检测，应置于 -20 ℃以下冷冻保存。采集的血清样品可用冰袋或保温 桶加冰密封等方式冷藏运输，运输时间应尽量缩短，确保样品有效。 9 检测方法 9.1 样品及对照血清 稀释：用样品稀释液将待检血清样品 及对照血清按 1:10进行稀释（例如： 10 μL样 品加 90 μL样品稀释液）。 9.2 补体稀释：用样品稀释液将补体作 1：200稀释。 9.3 HRP补体 C1q抗体稀释：用样品稀释液将 HRP补体 C1q抗体按标定效价稀释。 9.4 用纯化水将 20倍浓缩洗涤液稀释至工作浓度。 9.5 加样：检测孔加入稀释后的样品血清 50 μL。阳性对照血清与阴性对照血清各设 2孔，每孔分别加 入50 μL。 9.6 加补体：每孔加入稀释后补体 50 μL。 9.7 置37 ℃孵育 30 min。 9.8 洗涤：甩掉孔中液体，加入洗涤液 200 μL/孔洗涤，反复洗涤 3次，每次在吸水纸上拍干。 9.9 显色液现用现配，将显色液 A和显色液 B 1:1混合后，每孔加入 100 μL，室温避光孵育 10 min，每 孔加终止液 50 μL终止反应。 9.10 检测： 30 min内在波长为 450 nm处用酶标仪读出各孔的 OD值。 10 结果判定 10.1 计算 N值 = 阴性对照平均 OD 450nm值； P/N值 = 阳性对照平均 OD 450nm值/阴性对照平均 OD 450nm值； S/N值 = 样品 OD 450nm值/阴性对照平均 OD 450nm值。 中国兽医协会 CVM