ICS 67.220.10 CCS GBC X 44 广西物品编码与标准化促进会团体 标准 T/GBC 92—2025 八角茴香真伪快速鉴别 实时荧光 PCR法 Quick identification of authenticity of anisi stellati fructus — Real-time PCR method 2025 - 09 - 22发布 2025 - 10 - 22实施 广西物品编码与标准化促进会 发布 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GBC 92 —2025 I 前言 本文件按照 GB/T 1.1 —2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由广西 -东盟食品检验检测中心 [国家市场监督管理总局技术创新中心（天然香料香精） ]提 出。 本文件由广西物品编码与标准化促进会归口。 本文件起草单位：广西 —东盟食品检验检测中心 [国家市场监督管理总局技术创新中心（天然香料 香精）]、玉林市食品药品检验检测中心、广州双螺旋基因技术有限公司、 广西民生中检联检测有限公 司、广西壮族自治区标准技术研究院、广电计量检测（南宁）有限公司、玉林师范学院、江西省检验检 测认证总院工业产品检验检测院、南通中智检测服务有限公司。 本文件主要起草人：李锐、陈宇、王海波、冯婷、巫坚、卢森华、樊文研、韦涛、张璜、陈灏挺、 戴向东、韦春梦、韦兰青、陆柔、黄海霞、杨尚超、邓玉秀、韦升坚、谢庆剑、钟超凡、卢艺、赵刚、 苏周雯、黄漫漫、杜妮、王书龙、丘一仙、唐明华、周晓婷、韦应、麦荣阳、陆峥莹、李玉群、雷奇烨、 孙竟雅。 本标准版权为广西物品编码与标准化促进会所有，除了用于国家法律或事先得到广西物品编码 与标准化促进会的许可外 ,不得以任何形式或任何手段复制、再版或使用本标准及其章节 ,包括电子 版、影印件 ,或发布在互联网及内部网络等。 全国团体标准信息平台 全国团体标准信息平台 T/GBC 92 —2025 1 八角茴香真伪快速鉴别 实时荧光 PCR法 1 范围 本文件界定了八角茴香真伪快速鉴别 实时荧光 PCR法的术语和定义，规定了八角茴香真伪快速鉴 别 实时荧光 PCR法的缩略语、原理、试剂和材料、仪器设备、试样制备、检验步骤、质量控制措施、结 果判定及表述和检测过程中防止交叉污染的措施。 本文件适用于八角茴香的原果、碎体及粉末真伪的实时荧光 PCR鉴别，八角茴香鲜果可参照执行。 检出限（ LOD）5％（质量分数）。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中， 注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19495.3 转基因产品检测 核酸提取纯化方法 GB/T 27403 —2008 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 八角茴香 anisi stellati fructus 又称八角，为木兰科植物八角茴香 lllicium verum Hook.f的干燥成熟果实。秋、冬二季果实由绿 变黄时采摘，置沸水中略烫后干燥或直接干燥。 实时荧光 PCR Real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，通过荧光信号的积累实时监控整个 PCR扩增过程。 [来源：GB/T 38164 —2019，3.1.1] Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。 [来源：GB/T 38164 —2019，3.1.2] 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（ Deoxyribonucleic acid ） CTAB：十六烷基三甲基溴化铵 (Cetyltrithylammonium bromide) RNA酶：核糖核酸酶 (Ribonuclease) TE：三羟甲基氨基甲烷 乙二胺四乙酸 (Tris EDTA) OD：光密度值 (Optical density) 全国团体标准信息平台 T/GBC 92 —2025 2 5 原理 基于CTAB前处理方式提取植物源性成分的特异核苷酸片段，以八角茴香 DNA为模板，利用八角茴香 物种特异性引物及探针进行实时荧光 PCR扩增检测，同时设置阳性、阴性及空白对照。根据 PCR扩增反应 产物荧光信号及扩增曲线判定，实现对样品中 植物源性成分的定性分析 6 试剂和材料 试剂 除另有规定外，所有试剂均为分析纯或生化试剂。实验用水符合 GB/T 6682 中一级水的要求。试剂 配制按照 GB/T 19495.3 执行。所有试剂均用无 DNA酶污染的容器分装。 检测用引物和探针 引物和探针序列见表 1。 表1 引物和探针序列 引物名称 序列 基因来源 八角茴香 F：TCGATGGTCCCTTGAGGAGTA NCBI R：GCGCCGATGTTGGTTGTT NCBI P：FAM-AGAAACATGGGAGGGTGG -MGB NCBI 注： F代表上游引物； R代表下游引物； P代表探针。 材料 6.3.1 灭菌的离心管和移液器吸头。 6.3.2 2 mL收集管。 7 仪器设备 实时荧光 PCR仪。 核酸蛋白分析仪。 微量移液器（ 10 μL、100 μL、200 μL、1000 μL）。 恒温振荡水浴。 离心机（最大转速 14 000 r/min）。 涡旋振荡器。 组织粉碎机。 电子天平：感量 0.001 g。 高压灭菌锅。 8 试样制备 原料样品：用组织粉碎机把样品粉碎，备用。 9 检验步骤 样品DNA提取 在核酸提取区进行。称取 15 mg～40 mg样品或50 mg～150 mg鲜果样品置于 2 mL离心管中，加入 600 μ L的CTAB-1提取缓冲液 (pH8.0)和20 μL的RNA酶，振荡混匀， 65℃孵育45 min～60 min，期间每隔 10 min 振荡混匀；反应完后冷却 10 min，加入500 μL的苯酚[C6H5OH]：三氯甲烷 [CHCl 3]∶异戊醇 [C5H12O](25∶ 24∶1)充分振荡混匀，静置 10 min，12 000r/min 离心5 min；小心吸取 250 μL～400 μL上清液至洁净的 全国团体标准信息平台 T/GBC 92 —2025 3 1.5 mL离心管内，加入等体积的异丙醇 [C3H8O]振荡混匀， 12 000r/min 离心5 min；弃去上清液， 500 μL 的70％乙醇[C2H6O]洗涤2次，12 000r/min 离心5 min，弃上清液，晾干；加入 50 μL～100 μL的TE缓冲液 （pH8.0）或无菌双蒸水，溶解 DNA，－20℃保存备用。同法提取阳性对照、阴性对照。 或使用商品化的 植物基因组DNA提取试剂盒进行提取。 DNA浓度和纯度的测定 取1 μL的DNA溶液，使用核酸蛋白分析仪检测其浓度及质量，浓度大于 30 ng/μL且OD260/OD280在 1.7～1.9之间时，适宜于 PCR扩增。 实时荧光 PCR检测 反应体系总体积 25 μL，2×实时荧光定量 PCR反应液12.5 μL；上游引物（ 10 μmol/L）1 μL；下 游引物（ 10 μmol/L）1 μL；探针（ 10 μmol/L） 0.5 μL；样品DNA或对照5 μL；超纯水5 μL。也可使 用等效的商品化扩增试剂盒。 反应参数： 37℃ 10 min；95℃ 5 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，40个循环,在循环反应 60℃ 60 s采 集荧光信号。 实验对照 实验过程分别设阳性对照、阴性对照、空白对照。以八角茴香物种提取的 DNA为阳性对照，以已知 不含八角茴香的物种 DNA为阴性对照，以灭菌水为空白对照。样品和对照 应设置两个平行的反应体系。 10 质量控制措施 以下条件有一条不满足时，试验视为无效： a) 空白对照：无荧光信号检出， Ct值应≥40.0或无Ct值； b) 阴性对照：无荧光信号检出， Ct值应≥40.0或无Ct值； c) 阳性对照：有荧光信号检出，且出现典型的扩增曲线， Ct值＜35.0。 上述三项 若有一项不符合， 应重新进行扩增； 如再次扩增后依然不完全符合上述三点， 则实验无效。 11 结果判定及表述 结果判定 在符合10中3个对照组的情况下，检测结果按以下进行判定： d) 如Ct值≤35.0，曲线呈“ S”型扩增曲线，可判定样品检出八角茴香源性成分； e) 如Ct值≥40.0或无Ct值，曲线为直线或轻微斜线，无“ S”型扩增曲线 ，可判定样品未检出 八角茴香源性成分； f) 如35.0＜Ct值＜40.0，应调整模板浓度， 重复一次。如再次扩增后 Ct值仍为＜ 40.0，则判定 样品检出八角茴香源性成分 ；如再