ICS65.020.30 CCSB41 NXSLX 宁夏饲料工业协会团体标准 T/NXSLX0402—2025 猪丹毒杆菌荧光定量PCR检测方法 DevelopmentofTaqManreal-timePCRassayfordetectionof Erysipelothrixrhusiopathiae （报批稿） 在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。 2025-07-01发布 2025-08-01实施 宁夏饲料工业协会  发布 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0402—2025 I前言 本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件不涉及任何专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由银川市畜牧技术推广服务中心提出。 本文件由宁夏回族自治区饲料工业协会归口。 本文件起草单位：银川市畜牧技术推广服务中心、宁夏动物疾病预防控制中心、宁夏大学。 本文件主要起草人：宋前进、王小龙、曹晓真、路乾、刘治凤、刘溪源、邸静、王钰鑫、贺海燕、 徐誉彰、马建春、姜彦飞。 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0402—2025 II猪丹毒杆菌荧光定量PCR检测方法 1范围 本文件规定了猪丹毒杆菌（Erysipelothrixrhusiopathiae）荧光定量PCR检测方法的术语定义、仪器 设备与试剂、引物设计与阴阳对照制备、样品的采集、运输及保存、试验步骤、结果判定及其他。 本文件主要用于猪丹毒杆菌（Erysipelothrixrhusiopathiae）核酸检测，样本主要包括：猪组织样品、 血样及其细菌培养物。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489实验室生物安全通用要求 NY/T566猪丹毒诊断技术 NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 3.1猪丹毒（swineerysipelas）：也叫“钻石皮肤病”或“红热病”，是由猪丹毒杆菌引起的一种急性、热 性传染病。 3.2荧光定量PCR（Real-timePCR）：是一种在PCR扩增反应体系中加入荧光基团，通过对扩增反应 中每一个循环产物荧光信号的实时检测，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 4仪器设备与试剂 4.1仪器设备 生物安全柜、分析天平、水浴锅、高速离心机、实时荧光定量PCR仪、组织研磨器、-20℃冰箱、 涡旋震荡仪、移液器、自动核酸提取仪、离心管、PCR反应管。 4.2试剂 4.2.1提取试剂 使用商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒。 4.2.2荧光定量PCR反应液 应按照实时荧光定量PCR操作需求，选取所需的实时荧光定量PCR扩增试剂，试验用水符合GB/T 6682的要求。 5引物设计与阴阳对照制备 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0402—2025 III5.1引物设计 上游引物SE-F：5’-GTGGCGCATATAATCCCGTA-3’； 下游引物SE-R：5’-GCAAACGCAATGGCTTCT-3’； 荧光探针SE-probe：5’HEX-TGCTCGAAGAAATACGAATGATGTTACCTGAT GACATC-BHQ1-3’ 5.2阴性对照 以细菌基因组提取试剂盒的洗脱液替代DNA模板作为阴性对照。 5.3阳性对照 用已有的猪丹毒杆菌核酸为模板，用本文件5.1中的上下游引物扩增对应的核酸靶基因序列，并将 该序列连接到pMD19T载体中，作为阳性对照。 5.4样品的采集、运输及保存 5.5样品的采集、运输及保存参照NY/T541执行。 6试验步骤 6.1核酸提取 按照所选取的细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取。 6.2反应体系配制 采用反应体积为25µL，包括以下成分2×AceqPCRProbeMasterMix12.50µL，上游引物（10µmol/L）、 下游引物（10µmol/L）以及探针引物各0.50µL，ddH2O9.0µL，DNA模版2µL。将各试剂根据上述反 应体系、按每个反应23µL的用量配置荧光定量PCR反应预混液，将各试剂按使用量分装到PCR管中， 后加入2µL样品或对照的DNA模板，混匀，盖上管盖，放入荧光定量PCR仪，并记录样品放置顺序。 6.3荧光定量PCR扩增 将加好的样品按顺序放入荧光定量PCR仪记录好顺序后，并按以下程序进行设定并运行。 第一阶段：95°C5min，1个循环； 第二阶段：95°C4min，58°C30s，38个循环； 第三阶段：55°C30s，1个循环。 7结果判定 7.1阳性对照应出现特异性扩增曲线且Ct值<38，且阴性对照无特异性扩增曲线或无Ct值，则试验成 立；否则试验不成立。 7.2样品的扩增结果有特异性扩增曲线且Ct值≤38时，可判定为猪丹毒杆菌核酸阳性。 7.3样品的扩增结果Ct值>38或无特异性扩增曲线或无Ct值时，可判定为猪丹毒杆菌核酸阴性；样 品的扩增结果有特异性扩增曲线且38<Ct值≤40时，可初步判定为猪丹毒杆菌核酸可疑；对初步判定可 全国团体标准信息平台 T/NXSLX0402—2025 IV疑样品可进行复检，若复检的Ct值≤38，且出现特异性扩增曲线，最终判定为猪丹毒杆菌核酸阳性，否 则为猪丹毒杆菌核酸阴性。 8其他 8.1实验结束后进行关闭仪器、断水、断电。 8.2生物安全按GB19489实验室生物安全通用要求，进行操作。 ________________________________ 全国团体标准信息平台