以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5283 —2020 熊蜂微孢子虫检疫技术规范 Quarantine protocol for Nosema bombi 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5283—2020I前 言 本文件是根据 GB/T 1.1— 2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、中华人民共和国海口海关、福建农林大学、厦门 瑞德利校准检测技术有限公司、东莞市中鼎检测技术有限公司。 本文件主要起草人：张体银、郑腾、吴山楠、王武军、黄少康、张志灯、于师宇、白泉阳、 邓其馨、陈美传、曹维强。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5283—2020熊蜂微孢子虫检疫技术规范 1 范围 本文件规定了熊蜂微孢子虫的光学相差显微镜检查法、聚合酶链式反应和实时荧光聚合酶链式 反应检测技术。 本文件适用于熊蜂微孢子虫的检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 PCR 聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） Ct 循环阈值（Cycle threshold） ddH2O 双蒸水（Double -Distillation H2O） DNA 脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside triphosphate） EB 溴化乙锭（Ethidium bromide） TBE 三羟甲基氨基甲烷 -硼酸 -乙二胺四乙酸 （Trihydroxymethyl aminomethane -boric acid -ethylene diamine tetraacetic acid ） TE TE 缓冲液（Tris -EDTA buffer solution） 4 仪器和设备 4.1 捣碎机 4.2 光学相差显微镜 4.3 高压灭菌锅 4.4 PCR 仪 4.5 荧光 PCR 仪 4.6 高速冷冻离心机 4.7 微量移液器（0.5 μL~10 μL, 2 μL~20 μL, 20 μL~200 μL, 100 μL~1000 μL） 4.8 超净工作台 4.9 水平电泳仪 4.10 凝胶成像系统以正式出版文本为准2 SN/T 5283—20204.11 电子天平（感量 0.01 g） 4.12 冰箱（2 ℃ ~8 ℃和 -20 ℃） 。 5 试剂 5.1 水：符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 5.2 酚 / 三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 A.1。 5.3 三氯甲烷 / 异戊醇混合液，配制方法见附录 A.2。 5.4 TE 缓冲液。 5.5 10×PCR 缓冲液。 5.6 dNTPs（含 dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。 5.7 Taq DNA 聚合酶。 5.8 0.5×TBE 缓冲液（配制方法见附录 A.3） 。 5.9 上样缓冲液（配制方法见附录 A.4） 。 5.10 EB（10 mg/mL） ，配制方法见附录 A.5。 5.11 DNA 相对分子质量标准物 Marker。 5.12 DNA 纯化回收试剂盒。 5.13 普通 PCR 引物 上游引物 Nos -F1 ： 5 ’-CCA GCA GTA AAC TAT GCC -3’； 下游引物 Nos -R1 ： 5 ’-CTC GAA TCA GGA TTC TCT CAG -3； 5.14 荧光 PCR 引物和探针 上游引物 Nos -F2 ：5 ’-GTC TCT CAG GCT CCT TCT CC -3’； 下游引物 Nos -R2 ：5 ’-ATG TGC ACC GCA GAT AAC TA -3’； 探针 qPCR -P ：FAM -ACC GTT ACC CGT CAC TGC CTT GT -BHQ1 ； 6 采样 6.1 采样比例 6.1.1 当蜂群数量≤ 10 群时，所有蜂群均采样。 6.1.2 当数量在 11 群 ~100 群时，以 10 群采样量为基础，每增加 10 群，采样量增加 1 群。 6.1.3 当蜂群数量为 101 群 ~200 群时，按总群数的 15％采样。 6.1.4 当蜂群数量＞ 200 群时，以 200 群采样量为基础，每增加 20 群，采样量增加 1 群。 6.2 采样方法 从每个选定蜂群中采取活力较弱的熊蜂 30 只，放入烧杯内盖好，记录群号。检验前先将活蜂用 乙醚处死或置于冰箱冷冻室内冷冻 10 min。 7 实验室检测 7.1 形态学检测方法 7.1.1 样品处理 对处死后的蜂样品或死后新鲜的蜂样品，取其中肠，按照 1∶10 加入生理盐水，用捣碎机充 分捣碎（对干燥的死蜂样品，先剪去其头胸部，取其腹部，浸泡 12 小时后再捣碎） 。匀浆液用纱以正式出版文本为准3 SN/T 5283—2020网（50 目 ~100 目）过滤，收集滤液。滤液差速离心（500 r/min，离心 1 min，弃沉淀，然后上清液 以 5 000 r/min ，离心 10 min，弃上清液）2 次 ~3 次。用样本 1 倍 ~10 倍体积的生理盐水悬浮，做为 微孢子虫待检液。 7.1.2 镜检 从 7.1.1 制备的待检液中取出 2 个待检液样本 50 μL，滴于载玻片，盖上盖玻片，用 40×15（或 10）倍光学相差显微镜 2 人对检，先看中间，边调节微调旋钮，边慢慢移向四周，保证每个标本不少 于 20 个视野。 7.1.3 结果判定 光学相差显微镜下看到长约 5 μm~7 μm，宽约 3 μm~4 μm，外部形态短而宽，带有蓝色折光，边 缘发暗的椭圆形粒子就是微孢子虫，判为阳性（参见附录 B） 。 7.2 PCR 检测方法 7.2.1 引物 根据熊蜂微孢子虫 16S rRNA 基因核酸序列设计，扩增长度约为 213 bp，用 ddH2O 溶解至 10 μmol/L 后，保存于 -20 ℃备用。 7.2.2 设立对照 每次反应应设置空白对照、阴性对照和阳性对照。空白对照可用 ddH2O 代替样品；阴性对照为 未感染熊蜂微孢子虫的健康熊蜂腹部组织；阳性对照为感染熊蜂微孢子虫的熊蜂腹部组织。 7.2.3 DNA 的提取 7.2.3.1 分别取 7.1.1 待检液 0.5 mL 转移至 1.5 mL 离心管中，分别加入 0.2 mol/L KOH 0.5 mL，充分 混合，27 ℃诱导 1 h 后 5 000 r/min 离心 5 min，弃上清液。 7.2.3.2 用 0.5mL 生理盐水重悬，25 ℃放置 30 min。每管加入 0.5 mL 饱和酚，颠倒充分混匀 5 min， 4 ℃ 12 000 r/min 离心 10 min。 7.2.3.3 取水相至另一干净离心管 ，加入等体积的酚/三氯甲烷/异戊醇 （三者体积比为 25∶24∶1） ，上下颠倒混匀 5 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心 10 min。 7.2.3.4 取水相至另一干净离心管，加入等体积的三氯甲烷 / 异戊醇（三者体积比为 24∶1） ，上下 颠倒混匀 5 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心 10 min。 7.2.3.5 取水相至另一干净离心管，加入 2 倍体积预冷的异丙醇沉淀 DNA，轻轻混匀，4 ℃ 12 000 r/min 离心 15 min，彻底去除上清。 7.2.3.6 用 600 μL 70% 预冷的乙醇洗涤沉淀，4 ℃下 12 000 r/min 离心 10 min，弃上清，再瞬时离心， 用移液器彻底吸除酒精，在超净工作台上自然晾干。 7.2.3.7 加入 20 μL TE 溶液溶解 DNA， -20 ℃下保存。 7.2.3.8 空白对照、阴性对照和阳性对照从 7.1.1 开始进行同步操作。 7.2.3.9 DNA 提取也可选用等效的商品化试剂盒。 7.2.4 PCR 扩增 7.2.4.1 反应体系 普通 PCR 反应体系见表 1。PCR 扩增也可以采用等效的商品化 DNA 扩增试剂盒。以正式出版文本为准4 SN/T 5283—2020表 1 普通 PCR 反应体系 名称 储存液浓度 终浓度 加样量 10×PCR 缓冲液 10× 1× 2.5 μL dNTPs 10 mmol/L 0.2 mmol/L 0.5 μL Taq DNA 聚合酶 5 U/μL 0.1 U/μL 0.5 μL 上游引物 Nos -F1 10 μmol/L 0.4 μmol/L 1.0 μL 下游引物 Nos -R1 10 μmol/L 0.4 μmol/L 1.0 μL 模板 DNA — — 2.0 μL ddH2O — — 17.5 μL 总体积 — — 25 μL ’ F反应体系中各试剂的量可根据反应体系总体积进行适当调整。 7.2.4.2 反应程序 94 ℃预变性 5 min ；之后 94 ℃变性 45 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸