以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5281—2020 禽坦布苏病毒病检疫技术规范 Quarantine protocol for avian Tembusu virus infection 2020 -12-30 发布 2021 -07-01 实施ICS 1.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 开本  880×1230  1/16   印张  0.75   字数  24  千字 2021 年 6 月第一版   2021 年 6 月第一次印刷 印数 1—500 书号：155175·2   定价  16.00 元禽坦布苏病毒病检疫技术规范行 业  标   准 SN/T 5281—2020 * * *北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023） 编辑部：（010）65194242 -7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行 网址 www.customskb.com/book以正式出版文本为准 SN/T 5281—2020I前 言 本文件是根据 GB/T   1.1—2020 给出的规则起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国福州海关、福建省农科院畜牧兽医研究所、中华人民共和国 南京海关、东莞市中鼎检测技术有限公司、厦门市翰均科检测科技有限公司、中华人民共和国青岛 海关。 本文件主要起草人：郑腾、万春和、王凯民、张体银、黄瑜、林杰、程龙飞、张险朋、傅光华、 曹维强、施少华、张志灯、陈红梅、王武军、傅秋玲、陈美传、陈国强、白泉阳、李宋钰、徐彪、 徐超。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5281—2020禽坦布苏病毒病检疫技术规范 1 范围 本文件规定禽坦布苏病毒病的临床诊断和反转录 - 聚合酶链式反应鉴定技术。 本文件适用于禽坦布苏病毒病的临床诊断和实验室检疫。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682   分析实验室用水规格和试验方法 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。以下缩略语适用于本文件。 RT-PCR 反转录聚合酶链式反应（Reverse   transcription   polymerase   chain   reaction） DEPC 焦碳酸二乙酯（Diethy   pyrocarbonate）   DNA 脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic   acid） dNTP 三磷酸脱氧核苷酸（Deoxynucleoside   triphosphate） EB 溴化乙锭（Ethidium   bromide） PBS 磷酸盐缓冲液（Phosphate   buffered   saline） RNA 核糖核酸（Ribonucleic   acid） TAE 三羟甲基氨基甲烷 - 硼酸 - 乙二胺四乙酸（Trihydroxymethyl   aminomethane -boric acid-  ethylene diamine   tetraacetic   acid   ） 4 临床诊断 4.1 发病症状 当禽（尤其是种禽、蛋禽）出现以下部分或全部情形时，可作为初步诊断的依据之一：体温急剧 升高，采食量骤降；双脚无力，共济失调或（和）双翅下垂；产蛋率骤降；种禽、蛋禽还会出现开产 种（蛋）禽产蛋率上升慢，持续低产蛋率，无产蛋高峰或（和）产蛋率时高时低，后备种（蛋）禽开 产推迟或（和）产蛋不整齐。 4.2 病理变化 当禽（尤其是蛋禽）出现以下肉眼可见病变时，可作为初步诊断的依据之一：种禽、蛋禽卵巢（卵 泡）出血；种禽、蛋禽卵泡内卵黄液化，卵泡变形；种禽、蛋禽腹腔内积有淡红色血水或淡黄色浑浊 液体；种禽、蛋禽卵巢（卵泡）萎缩，卵泡数量减少。肉禽肝脏局灶性出血或（和）脑组织轻度出血。以正式出版文本为准2 SN/T 5281—20204.3 临床诊断 当禽（包括后备种禽、蛋禽） 出现以上病症，结合剖检病变，可初步诊断为疑似禽坦布苏病毒病， 需要进一步进行实验室确诊。 5 样品采集 根据临床症状和剖检病理变化情况，无菌采集疑似发病的禽、濒死禽或死亡禽（尤其是种禽、蛋 禽）的卵巢、肝脏样品，采集的样品在冷藏条件下 24   h 内送达实验室检测。 6 实验室诊断 6.1 设备 6.1.1 组织匀浆器。 6.1.2 高速台式冷冻离心机。 6.1.3 微量移液器。 6.1.4 PCR 仪。 6.1.5 电泳仪。 6.1.6 电泳槽。 6.1.7 紫外凝胶成像系统。 6.2 试剂 6.2.1 水，应符合 GB/T   6682 所规定一级水的要求。 6.2.2 磷酸盐缓冲液（PBS） ，配制方法见附录 A.1。 6.2.3 RNA 提取试剂 Trizol。 6.2.4 三氯甲烷。 6.2.5 异丙醇。 6.2.6 DEPC 水，配制方法见附录 A.2。 6.2.7 75% 乙醇，配制方法见附录 A.3。   6.2.8 反转录酶。 6.2.9 Taq DNA 聚合酶。 6.2.10 RNA 酶抑制剂。 6.2.11 脱氧核苷酸三磷酸 dNTPs（含dCTP、dGTP、dATP、dTTP） 。 6.2.12 引物（Primer） ：20  μmoL/L。根据禽坦布苏病毒的非结构蛋白NS5基因保守区序列设计，扩 增长度为 469   bp，序列中含有简并碱基 Y   =C/T。 上游引物 F ：5 ’- CTAYCAYGGAAGYTACGAAGT  -3’ 下游引物 R ：5 ’- CTTTTCTCGCTTYCCCATCAT  -3’ 6.2.13 溴化乙锭溶液，配制方法见附录 A.4。 6.2.14 1×TAE 缓冲液，配制方法见附录 A.5。 6.2.15 1.0% 琼脂糖凝胶，配制方法见附录 A.6。 6.2.16 10× 加样缓冲液，配制方法见附录 A.7。 6.2.17 DNA 相对分子质量标准物 DL   2   000   DNA   Marker。 6.2.18 DNA 纯化回收试剂盒。以正式出版文本为准3 SN/T 5281—20206.3 样品处理 将采集的样品或组织经剪碎处理后，与磷酸盐缓冲液按照体积比1：4的比例制成组织匀浆液， 反复冻融 3 次，8   000   r/min 离心 30   min，取上清液冻存分装备用。 6.4 RNA 提取 6.4.1 以灭活的禽坦布苏病毒为阳性对照；以其他灭活禽源RNA病毒（如鸭Ⅰ型肝炎病毒）为阴性 对照；以 DEPC 水为空白对照。对照样品与待检样品同步操作进行提取 RNA。 6.4.2 在经DEPC水处理的1.5   mL灭菌离心管中，分别加入250  μL组织匀浆上清液或对照样品，再 加入 750  μL RNA 提取试剂 Trizol，充分混匀 15   s。加入 200  μL预冷的三氯甲烷，充分混匀，室温静 置 10 min。 6.4.3 4 ℃下12   000   r/min离心15   min后，小心吸取上清液600  μL，加入经DEPC水处理的1.5   mL灭 菌离心管中，再加入 600  μL经 -20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀。 6.4.4 4 ℃下12   000   r/min离心15   min后，轻轻倾倒掉上清液，分别加入800  μL的75%乙醇清洗2次， 倒置于吸水纸上 5   min，室温晾干。 6.4.5 加入 20  μL DEPC 水，轻轻混匀，溶解离心管壁上的 RNA，2   000   r/min 离心 30   s。提取的 RNA 应在 2 h 内进行 RT -PCR 扩增或保存于 -20℃冰箱备用。 6.4.6 RNA 的提取也可采用市售等效的商品化核酸 RNA 提取试剂盒，按照说明书的要求进行操作。   6.5 RT-PCR 扩增 6.5.1 RT-PCR 反应体系为 50  μL，每个反应管依次加入20  μL DEPC 水、5  μL 的 10×One   Step   RNA   PCR Buffer、10  μL 的 MgCl2   ( 浓度为 25   mol/L)、5  μL 的 dNTP   Mixture   ( 浓度为 10   mol/L)、1  μL 的 RNA 酶抑制剂   ( 浓度为 40   U/μL)、1 μL 的反转录酶 AMV   ( 浓度为 5   U/μL)、1 μL 的 Taq 酶   ( 浓度为 5   U/μL)、 1 μL 的上游引物 F   ( 浓度为 20  μmoL/L)、1  μL 的下游引物 R   ( 浓度为 20  μmoL/L)、5  μL 提取核酸 RNA。 混匀后 2  000   r/min 离心 15   s，使反应混合液都沉降到管底。 6.5.2 将上述反应混合液按照以下步骤进行一步法RT -PCR扩增：第一步是反转录，42   ℃反转录30   min ； 第二步 PCR 循环，94   ℃预变性 5   min 后进入 PCR 循环，循环参数为 94   ℃变性 50   s、54   ℃退火 30 s、72  ℃延伸 35   s，循环 30 次；第三步 72   ℃   延伸 7   min。 6.5.3 RT-PCR的扩增也可采用等效的市售商品化的RT -PCR检