以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5279 —2020 鳗鲡疱疹病毒感染检疫技术规范 Quarantine protocol for infection with Herpesvirus anguillae 2020 -12-30发布 2021 -07-01 实施ICS 11.220 CCS B 41 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准以正式出版文本为准 SN/T 5279—2020I前 言 本文件按照 GB/T 1.1— 2020 的规定起草。 本文件由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本文件起草单位：中华人民共和国厦门海关、中华人民共和国海口海关、中华人民共和国深圳 海关 本文件主要起草人：郭书林、吴山楠、王津津、陈信忠、丁亦男、刘荭、杨俊萍、龚艳清、 孔凡德。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5279—2020鳗鲡疱疹病毒感染检疫技术规范 1 范围 本文件规定了鳗鲡疱疹病毒的 PCR 和荧光探针 PCR 检测方法。 本文件适用于鳗鲡疱疹病毒感染的检疫鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文 件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适 用于本文件。 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 18088 出入境动物检疫采样 SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范 3 术语、定义和缩略语 本文件没有需要界定的术语和定义。下列缩略语适用于本文件。 HVA ：鳗鲡疱疹病毒（Herpesvirus anguillae） PCR ：聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction） Taq酶：水生栖热菌 DNA 聚合酶（Thermus Aquaticus DNA Polymerase） 4 HVA 感染概述 鳗鲡疱疹病毒感染由鳗鲡疱疹病毒引起，该病毒的英文名称为 Herpesvirus anguillae（HVA） ，也 作 Anguillid herpesvirus 1 (AngHV1)。被感染的鳗鲡可不表现临床症状，产生的临床症状不具备典型特 性。HVA 的流行病学、病原特征等参见附录 A。 5 试剂和材料 用水若非注明，应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。除另有规定，所用试剂均为分析纯。 5.1 Taq 酶（5 U/L） ： -20℃ 保存，不要反复冻融。 5.2 PCR 引物 (20 μmol/L) ：下列 PCR 引物可以特异性扩增 HVA 的一个大小为 394 bp 的 DNA 片段。 5.2.1 上游引物 HVAPOLVPSD ： 5 ’- GTGTCGGGCCTTTGTGGTGA -3’ 5.2.2 下游引物 HVAPOLOOSN ： 5 ’- CATGCCGGGAGTCTTTTTGAT -3’ 5.3 荧光探针 PCR 引物（10 μmol/L） 。 5.3.1 上游引物 AngHV1.CapProt.F06: 5 ’- TGCTCTTGGAGTCGGTTGATG -3’ 5.3.2 下游引物 AngHV1.CapProt.R06: 5 ’- CCGTGTGGGAAAAGACTATTTGA -3’ 5.4 荧光探针 PCR Taqman 探针 (5 μmol/L)：AngHV1.CapProt.pR06: 5 ’- TCTGAAAACCCGCTCGCCCTGA -3’，以正式出版文本为准2 SN/T 5279—2020其5 ’端和 3 ’端分别标记 6 -FAM 和 BHQ -1。 5.5 荧光探针 PCR 反应混合液：为商业试剂，主要成分为 AmpliTaq Gold DNA Polymerase，dNTPs， 实时荧光 PCR buffer。可采用同等效果的其他试剂。 6 仪器和设备 6.1 恒温水浴锅。 6.2 台式冷冻高速离心机。 6.3 PCR 仪。 6.4 电泳仪。 6.5 凝胶成像仪。 6.6 荧光 PCR 仪。 7 HVA 感染的诊断 7.1 临床症状的诊断 HVA 感染时，鳗鲡的群体间和个体间的临床症状有很大的不同，普遍存在的临床症状有胸鳍、 鳃盖、鳃丝出血。临床症状还可表现为体表黏液松弛、增生，继而脱落，体表出现黏液缺损斑块。随 着病情的发展，病变至真皮层，发生溃疡，穿孔并露出内脏，头部充血发红（红头） ，腹部皮肤出血， 鳃、部分鳍条及肛门充血，烂鳃，眼突和腹胀，肝脏肿大褪色或呈红色，肾脏肿大，胆囊膨大，肠 炎，持续死亡等。 7.2 采样 采样数量参照 GB/T 18088 和 SC/T 7103 规定。可根据样品的鲜活程度，分别采用充氧、4 ℃冷藏 或冷冻等方式保存运送到实验室。 7.3 取样部位 7.3.1 对于体长＞ 4 cm 的鱼体可取鳃、肝、脾、肾等部位进行检测。 7.3.2 对于体长≤ 4 cm 的鱼体，可以取整只进行检测。 7.4 组织 DNA 提取 7.4.1 在冰盒中通过研磨工具将组织块研磨成匀浆状，取约 25 mg 组织匀浆于 1.5 mL 离心管中，在 其中加入 500 μL 裂解缓冲液（见 B.1）和终浓度为 100 μg/mL 的蛋白酶 K（见 B.2） 。将上述离心管置 于 55 ℃水浴，孵育 1 h~2 h，使组织充分裂解。加入 350 μL 抽提液 1（见 B.3）充分混合后 12 000 g 离心 5 min。 取上层水相，加入 350 μL 抽提液 2 （见 B.4） ，充分混合后 12 000 g 离心 5 min。 取上层水相， 加入 1.5 倍体积 -20 ℃预冷的无水乙醇，混匀后室温放置 10 min 后 15 000 g 离心 10 min，弃上清。瞬 时离心，用移液器小心吸弃残留上清。室温放置 5 min 晾干沉淀。加入 10 μL 灭菌双蒸水，轻弹管壁 使沉淀溶解，即可用作 PCR 模板。 7.4.2 组织 DNA 提取也可以采用等效的商品化 DNA 提取试剂盒，根据说明书使用。以正式出版文本为准3 SN/T 5279—20207.5 PCR 检测及结果判定 7.5.1 PCR 扩增体系 10×PCR 缓 冲 液（ 见 B.5）5 μL，20 μmoL/L PCR 引 物（5.2） 各 1 μL，25 mmol/L MgCl2 5 μL， 10 mmoL/L dNTPs 1 μL，5 U/μL Taq酶（5.1）1 μL，DNA 模板 5 μL，加双蒸水至总体积 50 μL。 7.5.2 PCR 扩增条件 反应条件为 94 ℃预热 5 min，然后 94 ℃变性 40 s，65 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 60 s，共 40 个循环， 最后 72 ℃延伸 10 min，4 ℃保存。PCR 反应条件也可根据商业化 Taq 酶的说明书设定。 7.5.3 设立对照 取已经由 PCR 确诊为阳性的鳗鲡组织样本核酸提取物作为阳性对照模板。取已经由 PCR 确诊为 阴性的鳗鲡组织样本核酸提取物作为阴性对照模板。空白对照为无菌去离子水。 7.5.4 琼脂糖凝胶电泳 用 TBE 电泳缓冲液（见 B.6）配制 1.5% 的琼脂糖凝胶平板（含 0.5 μg/mL EB） ，约 0.5 cm 厚。将 6 μL 样品和 2 μL 上样缓冲液（见 B.7）混合后加入样品孔，设立 DNA 标准 Marker 作对照。30 mA 电 泳约 0.5 h，当溴酚蓝指示剂到达凝胶平板底部时停止。凝胶成像仪下观察核酸带。 7.5.5 结果判定 7.5.5.1 当阳性对照在大约 394 bp 位置出现单一的核酸条带，阴性对照没有该核酸条带，实验结果 成立。 7.5.5.2 样品在大约 394 bp 位置出现核酸条带者，取 PCR 扩增产物测序，测序序列在 Genbank 中进 行序列同源性比较，同源性为 95% 以上的可判为 HVA 核酸阳性。参考序列 Genbank 序列登录号为： KX027736.1，参考序列参见附录 C。 7.5.5.3 无扩增带、扩增带的大小不是 394 bp、测序结果与参考序列的同源性低于 95% 的样品可判 定为 HVA 核酸阴性。 7.6 荧光探针 PCR 检测及结果判定 7.6.1 荧光探针 PCR 扩增体系 在 0.2 mL PCR 薄壁管或八连管中，每个反应体系加入 2× 荧光探针 PCR 反应混合液（5.5） 10 μL， 10 μmoL/L 的荧光探针 PCR 引物（5.3）各 0.4 μL，5 μmoL/L 的荧光探针 PCR Taqman 探针（5.4） 0.3L， DNA 模板 5 μL，加入灭菌双蒸水至终体积为 20 μL。 7.6.2 荧光探针 PCR 扩增条件 反应条件为 95 ℃ 预热 10 min，然后 95 ℃ 变性 15 s，60 ℃ 30 s，40 个循环，每个循环结束采集 FAM 通道荧光信号。 7.6.3 设立对照 按 7.5.3 设阴性对照、阳性对照和空白对照。以正式出版文本为准4 SN/T 5279—20207.6.4 结果判定 7.6.4.1 阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点为准。 7.6.4.2 空白对照和阴性对照无 Ct 值，阳性对照出现典型的阳性扩增曲线，且 Ct 值小于 30，实验 有效。 7.6.4.3 若检测样品 Ct 值＞ 38，则判为 HVA 核酸阴性。若检测样品