以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 5276—2020 出口食品中多种过敏原的测定 液相色谱 -质谱/质谱法 Determination of multi -allergens in foodstuff of export — LC-MS/MS method 2020 -08-27发布 2021 -03-01 实施ICS 67.050 X 04 中华人民共和国海关总署 发 布以正式出版文本为准中华人民共和国出入境检验检疫 开本  880×1230  1/16   印张  1   字数  30  千字 2020 年 10 月第一版   2020 年 10 月第一次印刷 印数 1—500 书号：155175·294   定价  18.00 元出口食品中多种过敏原的测定 液相色谱 -质谱/质谱法行 业  标   准 SN/T 5276—2020   * * *北京市朝阳区东四环南路甲1号（100023） 编辑部：（010）65194242-7509 中国标准出版社秦皇岛印刷厂印刷中国海关出版社有限公司出版发行 网址 www.customskb.com/book以正式出版文本为准 SN/T 5276—2020I前 言 本标准按照 GB/T   1.1—2009 给出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海海关、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：古淑青、邓晓军、陈颖、张九凯、赵超敏、时逸吟、陈念念、曲栗、韩丽。以正式出版文本为准以正式出版文本为准1 SN/T 5276—2020出口食品中多种过敏原的测定 液相色谱 -质谱 / 质谱法 1 范围 本标准规定了加工食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生和坚果过敏原蛋白的液相色谱 -质谱/质谱检 测方法。 本标准适用于饼干、面包、饮料、早餐谷物等食品中牛奶、鸡蛋、大豆、花生、榛子、杏仁和 核桃过敏原蛋白的液相色谱 -质谱 / 质谱测定和确证。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 6682   分析实验室用水规格和试验方法 3 方法原理 试样中过敏原蛋白质经提取和纯化，二硫苏糖醇（DDT）还原,碘代乙酰胺（IAA）烷基化，碱 性胰蛋白酶酶解，液相色谱 -质谱/质谱检测。建立特征肽段的响应强度与过敏原含量的线性关系， 外标法定量。 4 试剂和材料 除另有规定外，所用试剂均为分析纯，水为符合 GB/T   6682 规定的一级水。 4.1 试剂 4.1.1 碳酸氢铵（NH4HCO3）。 4.1.2 二硫苏糖醇（C4H10O2S2，DTT） 。   4.1.3 碘代乙酰胺（ICH2CONH2，IAA） 。   4.1.4 氯化钙（CaCl2）。 4.1.5 乙酸（CH3COOH） ：色谱纯。 4.1.6 甲酸（HCOOH） ：色谱纯。 4.1.7 乙腈（CH3CN） ：色谱纯。 4.1.8 碱性胰蛋白酶：活力大于   10   000   BAEE 每毫克蛋白质。 4.1.9 三羟甲基氨基甲烷（C4H11NO3，Tris） 。 4.1.10 盐酸（HCl） 。 4.1.11 正己烷（C6H14） ：色谱纯。以正式出版文本为准2 SN/T 5276—20204.2 试剂配制 4.2.1 碳酸氢铵溶液（500   mmol/L）：称取 3.95   g 碳酸氢铵（4.1.1） ，用水溶解后定容至 100   mL。 4.2.2 二硫苏糖醇溶液（500   mmol/L） ：称取   0.771   g   二硫苏糖醇（4.1.2） ，用碳酸氢铵溶液（4.2.1） 溶解后定容至 10   mL。4   ℃冷藏可保存一个月。 4.2.3 碘代乙酰胺溶液（500   mmol/L） ：称取   0.925   g   碘代乙酰胺（4.1.3） ，用碳酸氢铵溶液（4.2.1） 溶解后定容至 10   mL。4   ℃避光冷藏保存一个月。 4.2.4 氯化钙溶液（100   mmol/L）：称取   0.111   g 氯化钙（4.1.4） ，用水溶解后定容至 10   mL。 4.2.5 乙酸溶液（1%，体积比） ：移取 0.1   mL   乙酸（4.1.5） ，用水稀释并定容至 10   mL。 4.2.6 牛胰蛋白酶溶液（500  μg/mL） ：称取   5   mg   碱性牛胰蛋白酶（4.1.8） ，用乙酸溶液（4.2.5）溶 解后定容至   10   mL。溶液于 -20   ℃可保存 6 个月。 4.2.7 甲酸的水溶液（0.1%，体积比） ：准确移取   1.0   mL   甲酸（4.1.6） ，用水定容至   1   000   mL。 4.2.8 甲酸的乙腈溶液（0.1%，体积比） ：准确移取   1.0   mL   甲酸（4.1.6） ，用乙腈（4.1.7）定容至   1 000 mL。 4.2.9 Tris-HCl 溶液（40   mmol/L） ：称取 2.42   g   Tris   （三羟甲基氨基甲烷） ，溶解于 800   mL 水中，用 10% 盐酸调节 pH 至 8.0±0.10，用水定容至 1   000   mL。 4.3 标准品 4.3.1 NIST SRM   8445 ：用于过敏原检测的喷雾干燥的全蛋粉   （spray -dried whole   egg   for   allergen   detection） 。 4.3.2 NIST SRM   2387 ：花生酱（peanut   butter） 。 4.3.3 NIST SRM   1549a ：全脂奶粉（whole   milk   powder） 。 4.3.4 NIST SRM   3234 ：大豆粉（soy   flour） 。 （或其他来源的标准参考物质也可以。 ） 4.4 标准溶液配制 4.4.1 NIST SRM   8445、SRM   2387、SRM   1549a、SRM   3234 蛋白提取液标准储备液：分别准确称 取 1 g NIST   SRM   8445、SRM   2387、SRM   1549a、SRM   3234，加入 Tris -HCl（4.2.9）溶液，定容至 20   mL。振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅60   ℃加热振荡提取 3   h。提取液以 10   000   r/min 高速离心 5 min，上清液过低蛋白质吸附的 0.45  μm 醋酸纤维滤膜后，用 Bradford 方法测定提取液中总蛋白的浓 度，提取液置于 -20   ℃冰箱内保存。 4.4.2 因难以购买到标准物质，实验中分别准确称取1   g烘焙后的榛子、核桃、杏仁，加入Tris -HCl （4.2.9）溶液，定容至20   mL。振荡均匀使试样完全溶解，置于水浴锅60   ℃加热振荡提取3   h。提取 液以 10 000   r/min 高速离心 5   min，上清液过低蛋白质吸附的 0.45  μm 醋酸纤维滤膜后，用 Bradford 方 法测定提取液中总蛋白的浓度，提取液置于 -20   ℃冰箱内保存。 4.4.3 系列标准工作溶液：准确移取适量的标准蛋白提取储备液，用空白基质溶液配制成最终浓度 为含全脂奶粉、鸡蛋：5   mg/L、10   mg/L、20   mg/L、100   mg/L、500   mg/L、1   000   mg/L，花生、大豆、 榛子、杏仁、核桃：10   mg/L、20   mg/L、40   mg/L、200   mg/L、800   mg/L、1   600   mg/L 的基质匹配标准工 作溶液。   5 仪器和设备 5.1 液相色谱串联质谱仪：配有电喷雾离子（ESI）源。 5.2 分析天平：感量为 0.01   mg、0.001   g、0.1   g。 5.3 恒温水浴锅。以正式出版文本为准3 SN/T 5276—20205.4 离心机：转速不低于 4   000   r/min。 5.5 离心管：50   mL 具塞塑料离心管，超滤离心管（10   kDa   截止膜） ，1.5   mL 低蛋白吸附离心管。 5.6 微孔滤膜：水相，0.22  μm。 6 试样制备与保存 6.1 试样制备 6.1.1 饼干、面制品、饮料、麦片 取有代表性样品500   g（精确至0.1   g） ，采用粉碎机粉碎后，再将其研磨成细粉状，装入洁净的 盛样容器内，密封并标明标记。 6.1.2 婴幼儿配方食品（不包括配方乳粉） 取有代表性样品 500   g（精确至 0.1   g） ，装入洁净的盛样容器内，密封并标明标记。 6.2 试样保存 在制样的操作过程中，应防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 7 分析步骤 7.1 试样前处理 称取混合均匀的固体试样约 2.0   g 或液体试样约 10   g（精确至 0.001g） ，于 50   mL具塞塑料离心管 中。对于脂肪含量高的样品，加入 10   mL 正己烷（4.1.11） ，涡旋   3   min   后，4   500   r/min   离心 5   min，除 去上层溶液。重复两次后，氮气吹干。加入20   mL   Tris-HCl溶液（4.2.9） ，振荡均