ICS 67.120.10 CCSX22 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3904—2021 肉及肉制品中杂环胺检测 液相色谱一串联质谱法 Determination of heterocyclic amines in meat and meat products by liquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2021-05-07 发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3904—2021 平青 公共服务平 典通 本文件按照GB/T1.1一2020标准化工作导则 起草。 本文件由农业农村部乡村产业发展司提出。 本文件由农业农村部农产品加工标准化技术委员会归口。 本文件起草单位：中国农业科学院农产品加工研究所、河南双汇投资发展股份有限公司、唐人神集团 股份有限公司、新希望六和股份有限公司、东北农业大学、中粮集团营养健康研究院、湖北安井食品有限 公司。 本文件主要起草人：张德权、惠腾、王振宇、孔保华、孟少华、刘欢、丁晓倩、单吉浩、张晓琳、潘腾、刘志 斌、胡忠良。 I NY/T3904—2021 肉及肉制品中杂环胺检测 液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件规定了附录A给定的肉及肉制品中13种杂环胺的液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于附录A给定的肉及肉制品中13种杂环胺的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件， 最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验另法 3原理 试样采用乙睛提取 小散固相 极技 标法定量。 4试剂和材料 所有剂 除另有规定外 为分析纯水为符合 4.1试剂 4.1.1乙酸（ COUH 色谱纯 4.1.2乙睛（ 4.1.3乙酸铵（ I.COONH 4.1.4甲醇（ OH): 4.1.5硫酸镁 SO 4.1.6无水醋酸 CH ONa. 4.2材料 4.2.1陶瓷均质 4.2.2N-丙基乙 4.2.3封尾C18固相率 真料：米 4.2.4有机相型微孔滤膜：0.22μm。 4.3试剂配制 4.3.11%乙酸-乙溶液：量取1.0mL乙酸（4.1.1)至100ml容量瓶中，用乙腈（4.1.2)稀释并定容至 刻度，摇匀。 4.3.2乙酸-乙酸铵缓冲液：准确称取0.7708g乙酸铵（4.1.3），溶于100mL水中，用乙酸（4.1.1)调 pH至2.90,转人1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。 4.4标准品 杂环胺标准品：应满足附录A的要求， 4.5标准溶液配制 4.5.1杂环胺标准储备液：分别称取10.0mgGlu-P-2、IQx、MelQ、Glu-P-1、8-MelQx、Norharman、4，8 DiMelQx、7，8-DiMeIQx、Harman、4,7，8-TriMelQx、PhIP、AαC、Trp-P-1(4.4)于100mL容量瓶中，用甲 醇（4.1.4)配制成浓度为100μg/mL的储备液；吸取10.0mL储备液到100mL容量瓶中，用甲醇 （4.1.4)稀释为10.0ug/mL的标准储备液，一18℃避光保存，有效期1个月。 1 NY/T3904—2021 4.5.2混合标准工作液：分别吸取0.01mL、0.02mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.50mL杂环胺标 准储备液（4.5.1)于100mL容量瓶中，用甲醇（4.1.4)稀释，得到杂环胺浓度分别为1.0ug/L、2.0μg/L、 5.0μg/L、10.0μg/L、20.0μg/L、50.0μg/L的混合标准溶液，现用现配。 5仪器设备 5.1液相色谱串联四极杆质谱：配有电喷雾离子源。 5.2电子天平：感量0.0001g和0.01g。 5.3离心机：转速≥10000r/min。 5.4pH计：感量0.01。 5.5氮气浓缩仪。 5.6涡旋振荡器。 5.7均质器。 5.8色谱柱：ZorbaxSB-Cig（2.1mm×50mm，1.8μm)。 注：非商业声明，此处列出的色谱柱仅供参考，不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家的色谱柱。 6分析步骤 6.1试样制备 取试样肉及肉制品中可食部分，捣碎混勾，标识后一18℃冷冻保存。 6.2试样处理 6.2.1提取 称取捣碎试样2g（精确至0.01g)于50mL离心管中，加人1块陶瓷均质子（4.2.1)和10mL水，振 荡20min；加人10mL1%乙酸-乙腈溶液（4.3.1)，振荡15min；加人4.0g硫酸镁（4.1.5）和1.0g无水 醋酸钠（4.1.6），涡旋混合1min。试样提取液在4℃、10000r/min条件下离心10min，分为上、中、下3 层，上层为含杂环胺的有机溶液，中层为肉泥，下层为水和陶瓷均质子，取上层有机溶液6mL供净化 使用。 6.2.2净化 向离心后的6mL待净化有机溶液中加入0.9g硫酸镁（4.1.5)、0.3gN-丙基乙二胺（PSA)（4.2.2) 和封尾0.3gCig固相萃取填料（4.2.3)，在1000r/min条件下均质1min，然后在4℃、10000r/min的 条件下离心5min；离心后取1.0mL上清液在30℃条件下氮气浓缩至近干，加入0.50mL甲醇（4.1.4） 溶液复溶得试样溶液，涡旋混匀，将试样溶液经微孔滤膜（4.2.4)过滤至进样瓶，待上机测定。 6.3测定条件 6.3.1液相色谱参考条件 a) 色谱柱：ZorbaxSB-Cis（2.1mm×50mm，1.8μm)； 流动相：A为乙酸-乙酸铵缓冲液（4.3.2),B为乙腈（4.1.2），梯度洗脱程序参见表1； c) 流速：0.4mL/min; 柱温：30℃； e) 进样量：2.0L。 表1流动相梯度洗脱程序 时间 流动相A 流动相B min % % 0. 0 95. 0 5. 0 0. 5 95. 0 5.0 5. 0 85.0 15. 0 2 NY/T 3904—2021 表1(续) 时间 流动相A 流动相B min % % 7. 0 73.0 27.0 8.0 45.0 55. 0 8.5 73. 0 27.0 9. 0 95.0 5. 0 10. 0 95.0 5. 0 6.3. 2 质谱参考条件 a) 电离方式：电喷雾电离正离子模工 ESI+)： b) 扫描方式：多反应监测（MRM)； c) 干燥气温度：200℃ d) 干燥气流量：10 min; e) 雾化气压力：4 V: 0 鞘气温度：2 g) 鞘气流量 h) 毛细管电 正电区4 OFV i) 喷嘴电 j) 定性离 对锥托电压和碰撞能量见表 表213种杂环胺的参考质谱参数 保留时 碰撞能量 序号 示准 eV 7805 37 1 25 30 2 132 30 198.09 27 3 45G 29 36 Glu R 4 :10 30 41 5 8-MeIQ 人 25 33 6 Norharman 3.912 69 48 30 7 4,8-DiMelQx 120 187.09 30 40 8 78-DiMelQx 4.015 120 187.15 30 115.15a 34 9 Harman 4.659 183.09 120 89.09 49 145.09a 42 10 4,7.8-TriMelQx 5.133 242.13 120 201.21 26 210.05a 30 11 PhIP 5.742 225.10 120 140. 08 30 140.13a 33 12 AaC 6.283 184. 07 120 167.07 24 195.14a 30 13 Trp-P-1 6.382 212.12 120 168.09 25 为定量离子。 3 NY/T3904—2021 6.4液相色谱-串联质谱测定 6.4.1定性测定 通过液相色谱将试样溶液进行分离后注入串联四极杆质谱仪中，得到相应的保留时间及信号响应值。 试样中目标化合物色谱峰的保留时间与相应标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在土2.5%之内。 每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，同一化 合物，样品中日标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3 规定的范围。 表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 >50 >20~50 >10~20 《10 允许的相对偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 6.4.2定量测定 以杂环胺混合标准工作液中杂环胺的浓度为纵坐标，以峰面积（响应值)为横坐标，绘制标准曲线，按 照外标法进行定量。通过液相色谱将试样溶液进行分离后注入串联四极杆质谱仪中，得到相应的响应值， 根据标准曲线得到目标化合物的浓度。待测试样溶液中杂环胺的响应值应在标准曲线范围内，超过线性 范围则应重新分析。重新分析时，根据超出线性范围倍数估算稀释倍数，用甲醇稀释使试样溶液浓度尽量 处于线性范围中部。杂环胺标准溶液的液相色谱图见附录B，特征离子质量色谱图见附录C。 6.5空白试验 除不加试样外，采用6.2的步骤进行平行操作。 结果计算和表述 试样中杂环胺含量按公式(1)计算。 (1) m 式中： X 试样中杂环胺含量的数值，单位为微克每千克（μug/kg)； 待测试样溶液稀释倍数； 根据标准曲线上计算得出的试样溶液中杂环胺浓度的数值，单位为微克每升（μg/L)； V 复溶后的试样溶液体积的数值，单位为升(L)