ICS 65.020.01 CCS B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3903—2021 枸杞中黄酮类化合物的测定 Determination of flavonoids in Lycium barbarum L. 2021-11-01实施 2021-05-07发布 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3903—2021 公共服务平台 典通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由农业农村部乡村产业发展司提出并归口。 心）、中国农业科学院农产品加工研究所。 本文件主要起草人：王晓菁、吴燕、张锋锋、牛艳、李庆鹏、王彩艳、杨静、赵子丹、刘霞、陈翔、开建荣、李 彩虹、石欣、王晓静。 I NY/T3903—2021 枸杞中黄酮类化合物的测定 1范围 本文件规定了构杞中总黄酮含量的分光光度计测定方法和枸杞中3种黄酮类化合物（见附录A)含量 的高效液相色谱测定方法。 本文件适用于枸杞（包含干果、鲜果)中总黄酮及黄酮类化合物含量的测定。 2规范性引用文件 件，仅该日期对应的版本 适用于 版本（包括所有的修改单）适用于 本文件。 AR GB/T6682 3术语和定义 本文件没有需要 长语和定义 JRAL 法分光光度法测定枸杞中总黄酮的含量 4原理 酮 枸杞中的总 己醇溶液提取后，在弱碱性条件下与铝盐生 加 氢氧化钠溶 液后显色，在波长 黄酮含量呈正 比，通过与标准 刘比较 D 5 试剂与材料 C 除非另有说明 芬析纯的试剂和CB 6682 5.1试剂 5.1.1无水乙醇（C) HOH 5. 1. 2 2亚硝酸钠(NaN CAS号 5.1.3硝酸铝[AI(NO3） H20,CA 784- 5.1.4氢氧化钠（NaOH,CA 1310-73-29 5.2溶液配制 5.2.1乙醇溶液（7+3)：取70mL无水乙醇加人30mlL水中，搅拌均勺、备用。 5.2.2乙醇溶液（3十7)：取30mL无水乙醇加人70mL水中，搅拌均匀、备用。 5.2.3亚硝酸钠溶液（50g/L)：准确称取5.00g亚硝酸钠于烧杯中，加适量水溶解，转人100mL容量瓶 中，用水定容至刻度，摇匀、备用。 5.2.4硝酸铝溶液（100g/L)：准确称取17.60g硝酸铝于烧杯中，加适量水溶解，转人100mL容量瓶 中，用水定容至刻度，摇匀、备用。 5.2.5氢氧化钠溶液（40g/L)：准确称取20.00g氢氧化钠于烧杯中，加适量水溶解，转入500mL容量 瓶中，用水定容至刻度，摇匀、备用。 5.3标准品 芦丁标准品（C27H3oO16CAS号：153-18-4)：纯度≥98%。 1 NY/T3903—2021 5.4标准溶液配制 芦丁标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取芦丁标准品0.05g（精确至0.0001g），用乙醇溶液 (5.2.1)溶解并定容至50.0mL棕色容量瓶，摇匀，配制成1.00mg/mL标准储备液。 6仪器与设备 6.1可见分光光度计。 6.2分析天平：感量0.0001g及0.01g。 6.3水浴振荡器：振荡频率不低于240r/min。 6.4离心机：转速不低于4000r/min。 6.5涡旋混合器。 6.6高速粉碎机：转速不低于10000r/min。 6.7破壁机：转速不低于10000r/min。 6.8比色皿：玻璃。 7分析步骤 7.1试样制备 7.1.1枸杞干果 去除枸杞中果柄等杂质，将样品置于一18℃冷冻12h以上或液氮冷冻，取出后立即用高速粉碎机粉 碎至枸杞中籽粒成粉末状，置于样品瓶中于一18℃冷冻保存，备用。 7.1.2枸杞鲜果 去除枸杞中果柄等杂质，用破壁机匀浆，测定。 7.2试样提取 7.2.1枸杞干果 称取粉碎试样1g（精确至0.0001g）于50mL离心管中，加人20mL乙醇溶液（5.2.1)涡旋混勺 1min，在60℃水浴200r/min振荡频率下振荡提取30min后，于4000r/min离心5min，上清液转入 50.0mL容量瓶中，残渣用20mL乙醇溶液（5.2.1)重复提取一次，合并上清液，冷却至室温后，定容至刻 度。准确吸取上清液1.00mL于10mL离心管，加入4.00mL无水乙醇，摇匀，静置5min，于4000r/min 离心5min，将上清液转入10mL比色管中，待测。 7.2.2枸杞鲜果 称取浆状试样10g（精确至0.01g)于50ml离心管中，其他提取步骤同7.2.1。 7.3标准曲线的绘制 分别吸取芦丁标准储备液（1.00mg/mL)0mL、0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.30mL、0.40mL、 0.50mL、0.60mL于10.0mL比色管中，加入4.00mL无水乙醇，摇匀，然后加人亚硝酸钠溶液（5.2.3） 0.5mL，摇匀；静置5min，加人硝酸铝溶液（5.2.4)0.5mL，摇匀；静置5min，加入氢氧化钠溶液（5.2.5） 2.0mL，摇匀。最后用乙醇溶液（5.2.2)定容，得到浓度为0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、 30.0mg/L、40.0mg/L、50.0mg/L、60.0mg/L的标准系列工作液，在波长508nm处测定吸光度。以芦 丁质量浓度β（mg/L)为横坐标、相应的吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线，得到标准曲线回归方程。 7.4测定 将7.2.1、7.2.2待测液中加人亚硝酸钠溶液（5.2.3)0.5mL，摇匀；静置5min，加人硝酸铝溶液 (5.2.4)0.5mL，摇匀；静置5min，加人氢氧化钠溶液（5.2.5)2.0mL，摇匀。最后用乙醇溶液（5.2.2)定 容至10.00mL，摇勾。试样于波长508nm处测定，以测得吸光值由标准曲线查得试样待测液中芦丁的 含量。同时做空白试验。 7.5空白试验 2 NY/T3903—2021 分取1.00mL乙醇溶液（5.2.1)于10.0mL比色管中，加人4.00mL无水乙醇，摇匀，其他步骤同 7.4。 8结果计算 试样中总黄酮含量以芦丁的质量分数计，按公式（1)计算 (p-po) ×Vi×V (1) mXV2X1000 式中： w 试样中总黄酮含量的数值，单位为毫克每克（mg/g)； 从标准曲线上查得试样待测液中总黄酮的质量浓度的数值，单位为毫克每升（mg/L)； po 从标准曲线上查得空白待测液中总黄酮的质量浓度的数值，单位为毫克每升（mg/L)； Vi 试样中加人并定 V3 试样的最终定容体积的数值，单位为毫升(L); S m 试样的质量的数值，单位为克（ V2 提取液分1 计算结果保留 效数 9精密度 S 在重复性条件 下，获得 2次独立测鼠结果的绝对差值不天于算木平均 10其他 A 本文件方法白 1mgg定量限子 3m U 二法高效液相色计 测定黄 合物的合 11原理 R 枸杞中的芦 糖升和异鼠李 香糖祥水仙苷）经甲醇 浴液提 是取后，C18柱分离，用 紫外检测器在波 外 TER 12试剂与材料 人 除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂租GB16682中规定 一级水。 12.1试剂 12.1.1甲醇(CH;OH,CAS号：67-56-1):色谱纯 12.1.2乙(CH;CN,CAS号：75-05-8) 色谱纯。 12.2溶液配制 甲醇溶液（7十3）：取70mL甲醇加入30mL水中，混匀后备用。 12.3标准品 芦丁、山奈酚-3-O-芸香糖苷和异鼠李-芸香糖苷（水仙苷)标准品，见附录A，纯度均≥98%。 12.4标准溶液配制 12.4.1芦丁标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取芦丁标准品0.05g（精确至0.0001g），用甲醇溶解并 定容至50.0mL棕色容量瓶，摇匀，配制成1.00mg/mL标准储备液，避光0℃~4℃保存。 12.4.2山奈酚-3-O-芸香糖苷标准储备液（1.00mg/mL)：准确称取山奈酚-3-O-芸香糖苷标准品0.05g （精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容至50.0mL棕色容量瓶，摇匀，配制成1.00mg/mL标准储备液， 避光0℃~4℃保存。 3 NY/T3903—2021 12.4.3异鼠李-芸香糖苷（水仙苷）标准储备液（1.00mg/mL）：准确称取异鼠李-芸香糖苷（水仙苷）标准 品0.05g（精确至0.0001g），用甲醇溶解并定容至50.0mL棕色容量瓶，摇匀，配制成1.00mg/mL标 准储备液，避光0℃～4℃保存。 12.4.4混合标准溶液配制：吸取一定量的3种标准储备溶液于50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻 度，混合标准溶液避光0℃～4℃保存。 12.5材料 微孔滤膜：0.45um，有机系。 13仪器和设备 13.1高效液相色谱仪(HPLC)：配有紫外检测器。 13.2分析天平：感量0.0001g。 13.3超声波清洗器。 13.4离心机：转速不低于4000r/min。 13.5涡旋混合器。 13.6高速粉碎机：转速不低于10000r/min。 13.7均质器：转速不低于24000r/min。 14分析步骤 14.1试样制备 14.1.1枸杞干果 同7.1.1。 14.1.2枸杞鲜果 同7.1.2。 14.2试样提取 14.2.1枸杞干果 称取粉碎试样约1g（精确至0.0001g)于50mL离心管中，加25.0mL甲醇溶液（12.2)，涡旋混勺 1min，超声提取60min（每间隔10min，振摇一次）或10000r/min匀浆2min后，于4000r/min离心 10min，上清液过滤膜（12.5），待测定。 14.2.2枸杞鲜果 称取匀浆试样约2g（精确