ICS 65.120 CCS B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3879—2021 饲料中25一羟基维生素D3的测定 Determination of 25-Hydroxy Vitamin D,in feeds 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 5发布 NY/T3879—2021 全国农业品标准 通 曲 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 本文件起草单位：上海市兽药饲料检测所、帝斯曼维生素（上海)有限公司。 本文件主要起草人：黄士新、商军、曹莹、张浩然、王博、严凤、华贤辉、张亦菲、田恺、黄家莺、吴剑平、徐 汀、张婧、贡松松、张进、王晓燕、虞哲高、肖平、石宝石。 NY/T 3879—2021 饲料中25-羟基维生素D3的测定 1范围 本文件规定了饲料中25-羟基维生素D.测定的高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。 本文件中高效液相色谱法适用于含量大于2mg/kg的添加剂预混合饲料中25-羟基维生素D:含量的 测定；液相色谱-串联质谱法适用于配合饲料、浓缩饲料和含量小于等于2mg/kg的添加剂预混合饲料中 25-羟基维生素D含量的测定。 本文件高效液相色谱法中添加剂预混合饲料的检出限为0.2mg/kg.定量限为1.0mg/kg。液相色 为10μg/kg；添加剂预混 2规范性引用文件 下列文件中的 通过文中 容 为规范 引用而构成本文件必 可少的 主日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用本 参改单)适用于本 文件。 S GB/T 6681 析实验 用水规格和试武验方活 GB/T201 动物饲 试样的制备 A 3术语和定义 R 本文件没有 4高效液相色谱 4.1原理 试样依次加水 ，超 声提 用高效液相色谱仪测 法定量。 4.2试剂或材料 R 4.2.1水:GB/T 4.2.2甲醇：色谱纯 人 4.2.385%甲醇溶液： mL甲醇.2 ，加水稀释至 4.2.4标准储备溶液（1mg/ml）：称取25羟） 基维生素D标准品（C27H H,O.CAS号：63283-36-3, 纯度不低于98%）25mg，准确至0.01mg，置手25ml棕色容量瓶中，用甲醇（4.2.2）溶解定容。于 20℃下保存，有效期为2个月 20mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.2.2)定容。于4℃冷藏保存，有效期为2周。 4.2.6标准中间溶液Ⅱ（25ug/mL）：准确移取标准中间溶液1（4.2.5)5.00mL于20mL棕色容量瓶 中，用甲醇（4.2.2)定容。临用现配。 4.2.7标准系列溶液：分别准确移取标准中间溶液Il（4.2.6)适量于棕色容量瓶中，用85%甲醇溶 液（4.2.3)稀释定容配成标准系列溶液，浓度分别为0.05ug/mL、0.5μg/mL、1μgmL、5ug/mL、 10μg/mL、25μg/mL。临用现配。 4.2.8微孔滤膜：0.22μm，有机系。 4.3仪器设备 4.3.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器/二极管阵列检测器。 1 NY/T 3879—2021 4.3.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg。 4.3.3离心机：转速不低于9000r/min。 4.3.4超声波仪：功率不低于280W。 4.4样品 按GB/T20195的规定制备试样，至少200g，粉碎使其全部通过0.42mm孔径的分析筛，充分混勾， 装人磨口瓶中，避光保存，备用。 4.5试验步骤 4.5.1试样溶液的制备 期间旋摇1次以防样品附着管底，加人甲醇（4.2.2)30mL，摇匀，超声提取20min，以6000r/min的转速 离心5min，将上清液转移至50mL棕色容量瓶中，用甲醇（4.2.2)定容至刻度，摇匀；过0.22um滤膜，待 上机。 4.5.2液相色谱参考条件 色谱柱：ThermoAQUASILCig柱，长150mm，内径3mm，粒径3μm，或性能相当者。 柱温：30℃。 检测波长：264nm。 流动相：A相为水，B相为甲醇（4.2.2），梯度洗脱程序见表1。 表1# 梯度洗脱程序 时间，min A相，% B相,% 0.00 15 85 10. 00 0 100 15.00 0 100 16.00 15 85 20.00 15 85 流速：0.6mL/min。 进样量：50L。 4.5.3测定 4.5.3.1标准系列溶液和试样溶液测定 D标准溶液的液相色谱图见附录A。 4.5.3.2定性 以保留时间定性，试样溶液中25-羟基维生素D:保留时间应与浓度相当的标准系列溶液的25-羟基维 生素D3的保留时间一致，其相对偏差在土2.5%之内。 4.5.3.3定量 以25-羟基维生素D：的浓度为横坐标、色谱峰面积（响应值)为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应 不低于0.999。试样溶液中25-羟基维生素D3的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试 样溶液用85%甲醇溶液（4.2.3)稀释（n倍)后，重新测定。单点校准定量时，试样溶液中25-羟基维生素 D3的浓度与标准溶液浓度相差不超过30%。 4.6试验数据处理 试样中25-羟基维生素D3(C27HO2·H2O)含量以质量分数计。多点校准按公式(1)计算,单点校准 按公式(2)计算。 1）ThermoAQUASIL是由美国赛默飞世尔科技（Thermo)公司提供的色谱柱商品。给出这一信息是为了方便本部分的使用者，并 不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 NY/T 3879—2021 :(1) mX1000 式中： W1 试样中25-羟基维生素D（C27H4O2·H,O)含量的数值，单位为毫克每千克（mg/kg）。 p1 从标准曲线查得的试样溶液25-羟基维生素D:的质量浓度的数值，单位为微克每毫升(μg/mL)； Vi 试样溶液的体积的数值，单位为毫升（mL）； n 试样溶液的稀释倍数； m 试样质量的数值，单位为克（g）。 AXpsXVX1000Xn (2) 式中： A A. 标准溶液中2 ps 标准溶液中 母毫升 +(ug/mL); Vi 试样溶液 的体 积的数值，单位为毫升m 测定结果以平 广测 的笑术 保留3位有效安 4.7精密度 在重复性条 当试样 T25基维生素D 20mkg时2 果与其算术平均 该算术平均值的当试样中 值的绝对差值不 5轻基维小素D kg 时，2次独立测 定结果与其算 值的维 对差值不人该算术平均值的 A 5 5.1原理 U 生工 试样经加水 后，月 用甲基叔子基（MIBE折 提取试 气吹干后，复 溶，用液相色谱 5.2试剂或材 5.2.1水:GB/ 5.2.2甲基叔丁 5.2.3甲醇：色谱 5.2.4甲酸：色谱纯 5.2.50.1%甲酸甲醇溶液 1mL甲酸（5 3稀释至1000 ，混勺。 5.2.60.1%甲酸溶液：1 用酸（5.2 加水稀释至L000mL，混勺 5.2.7 复溶液：85mL0.1%甲酸甲醇溶液（5.2.5），加0元 1%甲酸溶液 2.6)稀释至100mL，混匀。 5.2.8标准储备溶液（1mg/mL）：称 经基维生素D.标准品CC H4O2·H2O,CAS号：63283-36-3,纯 度不低于98%)25mg，准确至0.01mg，置于2 5ml棕色容量瓶中，用甲醇（5.2.3)溶解定容。于一20℃ 下保存，有效期为2个月。 5.2.9标准中间溶液（1μg/mL)：准确移取25-羟基维生素D，标准储备溶液（5.2.8）1.00mL于 1000mL棕色容量瓶中，用甲醇（5.2.3)定容。于4℃冷藏保存，有效期为1周。 5.2.10内标储备溶液（50ug/mL)：称取25-羟基维生素D3-d6标准品（CAS号：78782-98-6，纯度不低于 98%)2.5mg，准确至0.01mg，置于50mL棕色容量瓶中，用甲醇（5.2.3）溶解定容。于一20℃下保存， 有效期为2个月。 5.2.11内标工作溶液（1ug/mL)：准确移取内标储备溶液（5.2.10)1.00mL于50mL棕色容量瓶中， 用甲醇（5.2.3)稀释定容。临用现配。 5.2.12标准系列溶液：准确移取适量标准中间溶液（5.2.9)和内标工作溶液（5.2.11)于棕色容量瓶中， 3 NY/T 3879—2021 用复溶液（5.2.7)稀释定容，配成标准系列溶液，浓度分别为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、50ng/mL、 100ng/mlL、500ng/mL。内标浓度为100ng/mL。临用现配。 5.2.13微孔滤膜：0.22μm，有机系。 5.3仪器设备 5.3.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.3.2分析天平：感量0.1mg和0.01mg。 5.3.3离心机：转速不低于9000r/min。 5.3.4振荡器：振荡频率不低于1500r/min。 5.3.5涡旋混合器。 5.3.6氮吹仪。 5.4样品 按GB/T20195的规定制备试样，至少200g，粉碎使其全部通过0.42mm孔径的分析筛，充分混匀， 装入磨口瓶中，避光保存，备用。 5.5试验步骤 5.5.1试样溶液的制备 5.5.1.1配合饲料试样溶液制备 平行做2份试验。称取试样2g，准确至0.0001g，置于50mL离心管中，准确加人200μL内标工作 溶液（5.2.11）和5mL水，涡旋混匀后，于1500r/min振荡提取20min，准