ICS 67.120.10 CCS X 22 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3876—2021 猪肉中卡拉胶的检测 液相色谱一串联质谱法 Determination of carrageenan in pork-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3876—2021 豪台 通 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 起草。 本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。 本文件由全国屠宰加工标准化技术委员会（SAC/TC516)归口。 本文件起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、必维信诺（山东)检测技术有限公司。 本文件主要起草人：王君玮、王琳、邓书、丛睿、赵格、邵绪卿、江翠芸、高玉斌、宋时萍。 I NY/T3876—2021 猪肉中卡拉胶的检测 液相色谱-串联质谱法 1范围 本文件规定了猪肉中卡拉胶检测的制样和液相色谱-串联质谱测定方法。 本文件适用于鲜、冻猪肉中卡拉胶的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本义件；不注口期的用文解.其丧新版本(包括所有的修改)适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验 3术语和定义 RESE 4原理 试样经盐酸溶液 处理后 其中的卡拉胶 用液相 国联 被 质谱仪检测寡糖含 量，外标法定量 JRA 5试剂和材料 D 除另有说明 有试剂 为分析纯。 级刀 5.1试剂 5.1.2乙酸铵（CH COONH 5.1.3浓盐酸（H 5.1.4乙酸锌[(C 5.1.5亚铁氰化钾 5.2标准品 卡拉胶（CAS号：9000-07 1），纯度 5.3材料 5.3.1滤膜：水相，0.22μm。 5.3.2滤膜：有机相，0.22μm。 5.4溶液配制 5.4.10.005mol/L乙酸铵水溶液：称取乙酸铵0.39g，用水溶解并定容至1000mL，过0.22μm水相 滤膜。 5. 4. 2 190g/L乙酸锌溶液：称取乙酸锌19g，用水溶解并定容至100mL。 5.4.3 150g/L亚铁氰化钾溶液：称取亚铁氰化钾15g，用水溶解并定容至100mL。 5.4.4标准储备液（1000mg/L)：称取卡拉胶对照品0.0100g，加人适量水，60℃恒温水浴溶解。冷却 至室温后，转移至10mL容量瓶用水定容至刻度，即为1000mg/L储备液。临用现配。 6仪器设备 6.1液相色谱-串联质谱仪：配电喷雾离子(ESI)源。 NY/T 3876—2021 6.2 2分析天平：感量为0.0001g和感量为0.01g。 6. 3 低温高速离心机：转速≥8000r/min。 6.4涡旋混合器。 6.5 组织捣碎机。 6.6 匀浆机。 6. 7 恒温振荡水浴锅。 7 试样制备与保存 7.1试样的制备 取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，用组织捣碎机绞碎并均质： 取均质的供试样品，作为供试试样； 取均质的空白样品，作为空白试样。 7.2试样的保存 在一20℃以下保存。 8 试样处理 称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中。加人20mL水，于4℃10000r/min匀浆1min。 加入2mL浓盐酸，涡旋30s，置于80℃恒温振荡水浴锅振荡2h，取出后冷却至室温。依次加人1.5mL 190g/L的乙酸锌溶液、1.5mL150g/L的亚铁氰化钾溶液，涡旋1min沉淀蛋白质。于4℃8000r/ min离心5min，取上清液转移至50mL容量瓶中，用乙睛定容，过0.22um有机相滤膜，供液相色谱-串 联质谱仪测定。 9测定 9.1液相色谱参考条件 9.1.1色谱柱：BEHAmide柱(1.7um，2.1mmX100mm），或相当者。 9.1.2进样量：1μL。 9.1.3柱温：30℃。 9.1.4流速：0.4mL/min。 9. 1.5 流动相：A相：0.005mol/L乙酸铵水溶液；B相：乙睛。梯度洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 时间 A相 B相 min % % 0. 00 50 50 2. 00 50 50 2. 01 25 75 4. 00 25 75 4.01 50 50 6. 00 50 50 9.2质谱参考条件 9.2.1离子源：电喷雾电离源（ESI)。 9.2.2 参考质谱条件如下： a) 检测方式：多反应监测（MRM)； 2 NY/T3876—2021 b) 扫描模式：负离子扫描； c) 毛细管电压：一2.5kV(ESI-）； (P 干燥气温度：325℃； e) 干燥气流量：8L/min； D 雾化气压力：40psi； g) 鞘气温度：350℃； h) 鞘气流量：10L/min； D 多反应监测条件见表2。 表2卡拉胶降解产物的质谱参数 定量离子对 定性离子对 碎裂电压 碰撞能量 被测物名称 m/z m/z V ev 403.0>241.0 190 34 特征性寡糖 403.0>97.0 403.0>97.0 190 46 9.3标准曲线的制作 取5个50mL离心管，分别准确加入1000mg/L标准储备液50μL、100μL、250uL、500μL、1000 μL。然后加人23mL水，再加入2mL浓盐酸，加盖后在涡旋混合器涡旋30s，置于80℃恒温振荡水浴锅 振荡2h。取出后冷却至室温，转移至50mL容量瓶中，用乙睛定容，过0.22um有机相滤膜，分别注人液 相色谱-串联质谱仪中，即为1mg/L、2mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L工作液。以卡拉胶标准工作液 浓度为横坐标、定量离子的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。 9.4定性测定 通过试样色谱图的保留时间与相应标准溶液的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准溶液色 谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准溶液保留时间的相对偏差不大于5%，试样特征离子的相对丰 度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，相对丰度偏差不超过表3的规定，则可判断试样中存在相应的被 测物。 表3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 >50 20~50 10~20 10 允许的最大偏差 ±20 ±25 ±30 ±50 9.5定量测定 取试样溶液和标准溶液，按外标法，以峰面积定量。标准溶液及试样溶液中的卡拉胶降解产物特征性 寡糖响应值均应在仪器检测的线性范围内。在上述色谱-质谱条件下，卡拉胶降解产物特征性寡糖的特征 离子质量色谱图见附录A。 9.6空白试验 除不加试样外，采用完全相同的测定步骤进行测定。 10 结果计算 结果按公式(1)计算。 X=CXV (1) 式中： 试样中卡拉胶的含量数值，单位为毫克每千克（mg/kg）； c 由标准曲线计算出的样品溶液中卡拉胶的浓度数值，单位为毫克每升（mg/L)； V 试样溶液定容体积数值，单位为毫升（mL）； 3 NY/T3876—202 一试样称样量数值，单位为克（g）。 计算结果须扣除空白值。测定结果用平行测定的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。 11检测方法灵敏度、准确度和精密度 11.1灵敏度 本方法的检测限为3mg/kg，定量限为10mg/kg。 11.2准确度 本方法在10mg/kg~100mg/kg添加浓度水平上的回收率为70%~100%。 11.3精密度 在重复性条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。 GRI NY/T3876—2021 附录A （资料性） 卡拉胶降解产物特征离子质量色谱图 卡拉胶降解产物特征离子质量色谱图见图A.1。 响应值 × 102 4.5 4.0 403.0>97.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.2 0.4 0.6 0.81 1.2 1.4 1.6 1.8 2 2.2 2.4 2.6 2.8 33.2 3.4 3.6 3.84 4.2 4.4 4.6 4.85 5.2 5.4 5.6 5.8 ,min a）卡拉胶降解产物特征离子质量色谱图（403.0>97.0） 响应值 × 102 2.2 2.0 403.0>241.0 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.4 0.6 0.811.2 1.4 1.6 1.82 2.2 2.4 2.6 2.833.2 3.4 3.6 3.8 4 4.2 4.4 4.6 4.8 55.2 5.4 5.6 5.8 t,min b）卡拉胶降解产物特征离子质量色谱图（403.0>241.0） 图A.1卡拉胶降解产物特征离子质量色谱图 5