ICS 71.040.40 CCS X 41 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3870—2021 硒蛋白中硒代氨基酸的测定 液相色谱原子荧光光谱法 Determination of selenoamino acid in selenoprotein- Liquid chromatography-atomic fluorescence spectrometry 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3870—2021 全国农业品标准 公共服务平 本文件按照GB/T1.1- 2020《标准化工作导则 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：恩施土家族苗族自治州农业科学院、武汉大学、中硒健康产业投资集团股份有限 公司。 本文件主要起草人：陈永波、刘淑琴、李卫东、黄光昱、张朝阳、胡中立、陈娥、胡百顺、秦邦、刁英、熊倩 朱云芬、瞿勇、田宗仁、靳素荣。 I NY/T3870—2021 硒蛋白中硒代氨基酸的测定 液相色谱原子荧光光谱法 1范围 本文件规定了液相色谱-原子荧光光谱法测定硒蛋白中水解硒代氨基酸的方法。 本文件适用于硒蛋白水解后硒代氨基酸[硒代胱氨酸（SeCys2）、甲基-硒代半胱氨酸（MeSeCys）和硒 代甲硫氨酸（SeMet）含量之和的测定。 本文件适用于植物源硒蛋白和微生物源硒蛋白中硒代氨基酸的测定。 本方法的检出限分别为SeCys 0.070mg/kg.MeSeCys0.032mg /kg、SeMet 0.14 mg/kg。 2规范性引用文件 其中，注日期的引用文件， 仅注该日期对应的版 本适用 门用文件。 所 的修改单)适用于本 文件。 GB1903.28 养强化剂 用永规格和武验方法 GB/T6682 3术语和定义 下列术语 和定 义适用 本文件 3. 1 R 硒蛋白 noprotei 卫亚精 以含硒量较 的可食性植物、微 、水提、 燥等 青制而成的富含硒 养强化剂 代氨基酸的食 ［来源：GB190 3.28 2018 3. 2 硒代氨基酸 硒蛋白水解后 eCysMeSeCys和SeMe 4原理 人 硒蛋白经盐酸水解后分解成SeCysMeSeCs租S eMet等含硒氨基酸 色谱柱分离后由原子荧 光光谱仪测定。峰面积与溶液中被检测成分含 呈正比以保留时间定收 标法定量。 5试剂或材料 除非另有说明，本文件所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 5.1试剂 5.1.1盐酸(HCI)：优级纯。 5.1.2甲酸（HCOOH)。 5.1.3氢氧化钾（KOH)。 5. 1. 4 氢氧化钠(NaOH)。 5.1.5 碘化钾(KI)。 5. 1. 6 硼氢化钾（KBH,）。 5. 1.7 磷酸氢二铵［（NH），HPO,]。 1 NY/T3870—2021 5.2溶液配制 5.2.1盐酸溶液（6mol/L)：量取500mL盐酸（5.1.1)，用水定容至1000mL。 5.2.2磷酸氢二铵溶液（40mmol/L，pH=6.0)：称取5.282g磷酸氢二铵（5.1.7)溶于水中，加水至约 950mL，用甲酸（5.1.2）调节pH=6.0，用水定容至1000mL，0.45um滤膜（水相）过滤，超声脱气 2min~3min。 5.2.32%碘化钾十0.5%氢氧化钾溶液：称取20.0g碘化钾（5.1.5)、5.0g氢氧化钾（5.1.3)，用水定容 至1000mL。 5.2.41.5%硼氢化钾十0.5%氢氧化钾溶液：称取15.0g硼氢化钾（5.1.6）、5.0g氢氧化钾（5.1.3)，用 水定容至1000mL。 5.2.5盐酸溶液（10%）：量取100mL盐酸（5.1.1)，用水定容至1000mL。 5.2.6氢氧化钠溶液（6mol/L)：称取氢氧化钠（5.1.4)24g，用水定容至100mL。 5.2.7氢氧化钠溶液(1mol/L)：称取氢氧化钠(5.1.4)4g，用水定容至100mL。 5.3标准品 5.3.1硒代胱氨酸标准溶液（GBW10087)。 5.3.2甲基-硒代半胱氨酸标准溶液（GBW10088）。 5.3.3硒代甲硫氨酸标准溶液（GBW10034)。 5.4标准溶液配制 5.4.1硒代胱氨酸标准储备溶液：将硒代胱氨酸标准溶液（5.3.1)2mL转人10mL容量瓶中，用水定容 至10mL。 瓶中，用水定容至10mL。 5.4.3硒代甲硫氨酸标准储备溶液：将硒代甲硫氨酸标准溶液（5.3.3)2mL转人10mL容量瓶中，用水 定容至10mL 注：此标准储备溶液在4℃冰箱中保存，有效期为1个月。 5.4.4吸取5.4.1~5.4.3的标准储备液各1.00mL于10mL容量瓶中，用水定容，配置成混合标准工 作液。 6仪器设备 6.1高效液相-原子荧光联用仪（带阴离子交换柱和硒空心阴极灯）。 6.2微波蛋白水解仪。 6.3分析天平：感量0.01g和感量0.0001g。 6.4电位滴定仪或pH计。 6.5溶剂过滤装置。 注：实验中所用玻璃器ⅢL、石英杯均需以硝酸溶液(V硝酸：V水=1：4)浸泡过夜，用水冲洗干净。 7试验步骤 7.1试样保存 待检、已检硒蛋白样品需装在锡箔或铝箔包装袋中，放人4℃冰箱中保存。 7.2试样制备 称取试样20mg（精确到0.1mg）于微波蛋白水解仪（6.2)配套的内插杯内，加1mL6mol/L盐酸 溶液（5.2.1)，置于微波蛋白水解仪中150℃水解40min，水解液转移至小烧杯中，用6mol/L氢氧化钠 溶液（5.2.6)和1mol/L氢氧化钠溶液（5.2.7)调节pH至7.5，转移到25mL容量瓶中，加水定容后用 0.45um滤膜过滤，待测。同时做空白实验。 2 NY/T3870—2021 7.3标准曲线制作 将SeCyS2、MeSeCys和SeMet的混合标准工作溶液（5.4.4)0μL、10μL、20μL、30μL、40μL、50μL 分别导入仪器，测定其色谱峰，以Se含量为横坐标，峰面积为纵坐标，制作标准曲线。仪器条件参照附录 A，硒代氨基酸标准溶液色谱图见附录B中的B.1。 7.4试样测定 在与标准系列溶液相同的实验条件下，将10μL～50μL待测样品空白溶液和试样溶液分别导入仪 器，测定其峰面积，以保留时间定性，外标法定量，硒蛋白水解液色谱图见附录B中的B.2。 8试验数据处理 硒蛋白中SeCyS2、MeSeCys和SeMet的含量（以硒计）按公式（1)计算；硒代氨基酸总量等于样品中 SeCys2、MeSeCys和SeMet含量（以硒计）之和，按公式（2）计算。 (M-M。)XV,X1000 X SeAA= (1) mXV2 TseAA =X, + X2 + X3 (2) 式中： X seAA 试样中硒代氨基酸含量的数值（以硒计），单位为毫克每千克（mg/kg）； XI 试样中SeCys2含量的数值（以硒计)，单位为毫克每千克（mg/kg)； X2 试样中MeSeCys含量的数值（以硒计），单位为毫克每千克（mg/kg）； X: 试样中SeMet含量的数值（以硒计），单位为毫克每千克（mg/kg)； M 试样中硒代氨基酸质量的数值（以硒计），单位为纳克（ng）； Mo 样品空白中硒代氨基酸质量的数值（以硒计），单位为纳克（ng）； m 试样质量的数值，单位为毫克（mg）； Vi 水解液体积的数值，单位为毫升（mL）； V2 进样体积的数值，单位为微升（μL）； TseAA 硒代氨基酸之和（以硒计），单位为毫克每千克（mg/kg）。 结果以重复性条件下获得的2次独立测定结果的算术平均值表示，保留3位有效数字。 9精密度 在重复性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的10%，以大于算术平均值 10%的情况不超过5%为前提。 3 NY/T3870—2021 附录A (资料性) 高效液相-原子荧光联用仪参考条件 高效液相-原子荧光联用仪中液相色谱(LC)分离、氢化物（HG)发生和原子荧光光谱（AFS)测定条件 见表A.1。 液相色谱原子荧光光谱仪参考条件 流程 参数名称 参数条件 色谱柱 40mrh/kH HPO. NCOOH调节pH=6.0 LC分离 流速 HG发生 不原剂 KE 载流 外灯开关 元素灯 负高压 AFS测定 流（总电流辅电流） 80mA 300m NY/T 3870—2021 附录B （资料性） 硒代氨基酸标准溶液和硒蛋白水解液色谱图 SeCys2、MeSeCys和SeMet标准溶液的液相色谱图见图B.1,硒蛋白水解液的液相色谱图见图B.2。 荧光强度，mv 800- 700 MeSeCys 600- 500- SeCys, 400- 300 SeMet 200 100- 9 t,min 图B.1 SeCyS2、MeSeCys和SeMet标准溶液的液相色谱图 荧光强度，mv 900 SeMet 800 700 600 MeSeCys 500 SeCys 400 300 200 100 0 1 2 3 5 6 7 8 9 t,min 图 B. 2 硒蛋白水解液的液相色谱图 5