ICS 65.020.01 CCS B 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3862—2021 茶云纹叶枯病监测技术规程 Technical code of practice for monitoring tea brown blight disease 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3862—2021 言 全国农煎食品标准 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：华中农业大学、武汉海关技术中心。 本文件主要起草人：徐文兴、倪德江、王振华、王琴、宋育林、余志、郭飞。 I NY/T3862—2021 茶云纹叶枯病监测技术规程 1范围 本文件规定了茶云纹叶枯病的监测时期、监测点和监测方法。 本文件适用于全国各茶区茶云纹叶枯病的监测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过 冲的规范性引用而构成本 文件必 不可少的多 款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用 活所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T5018 3术语和定义 下列术语利 3. 1 茶云纹叶 茶叶枯 由山茶刺 包 Massees 起的 售，主要危害叶 片，可导致叶 落 枝条和果实，导致新梢枯死和树势衰 病的分布与危 害、症状、病原 染循环 3. 2 监测monit 对茶云纹口 3. 3 R 实时荧光定量 ive polymerase chain reaction 在PCR反应体 加人 利月 倍品和男实 整入 进程，最后通过Ct值 (cyclethreshold）和标准 线对起 生和定 斤的方法。 3. 4 五点式取样法 去five spot sampling metho 先确定对角线的中点作为中 点，再在对角线上选择 中点样点距离相等的点作为样点的 取样方法。 3. 5 发病率disease incidence 发病的普遍程度，用病叶（果、株）数占调查总叶（果、株）数的百分率表示。 3.6 病情指数diseaseindex(DI) 根据一定数目的植株或植株器官各病级数量计算平均发病程度的数值。 4鉴定方法 4.1样品采集 对随机选取叶片先进行目测，对出现黄绿色至深浅褐色、灰白色相间不规则形病斑叶片进行现场鉴 1 NY/T 3862—2021 定，并采集叶片进行室内鉴定。危害症状见附录A。 4.2实验室鉴定 4.2.1形态特征鉴定 将可疑的病变组织，剪成0.4cmX0.4cm小片，在1.0%（V/V)次氯酸钠溶液中消毒5min，灭菌水 冲洗3次，灭菌滤纸吸干水分后，置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基平板上，每皿放置3片～4片，25℃培养， 3d后开始观察。解剖镜下发现有菌丝长出，立即挑取菌落边缘菌丝，转人马铃薯葡萄糖琼脂培养基上纯 化培养。7d后用显微镜观察，记录其形态特征，参照附录A描述的病原菌形态特征进行鉴定。 4.2.2实时荧光定量PCR法鉴定 从现场采回的样品采用实时荧光定量PCR法进行分子鉴定，实验步骤按附录B的规定执行。 4.3结果判断 4.3.1病原形态特征鉴定 当从采集的样品叶片中分离获得的病原菌培养性状或形态特征应符合附录A描述特征，即可判定为 样本中含茶云纹叶枯病菌。 4.3.2实时荧光定量PCR法鉴定 样品采用实时荧光定量PCR法进行分子鉴定，如果空白对照和阴性对照没有扩增，同时阳性对照有 有效扩增，表示测定结果可靠，并根据阳性对照和阴性对照的Ct值判断茶叶是否有茶云纹叶枯病菌。 5监测方法 5.1监测植物 对茶云纹叶枯病感病和抗性较差的茶树品种和品系。 5.2监测时期 每年的5月10月。 5.3监测内容 5.3.1病情调查法 每个县（地区）选取代表性的3个～5个茶园作为观测点，每个点要求2.0亩以上茶园面积。采用5 点式取样法每点随机选取50个叶片，每隔10d调查一次。将调查结果填入表C(见附录C)。 5.3.2分级标准 茶云纹叶枯病的分级标准如下。 0级：无病； 1级：病斑面积占整片叶面积的10%以下； 2级：病斑面积占整片叶面积的10%～25%： 3级：病斑面积占整片叶面积的25%50%； 4级：病斑面积占整片叶面积的50%以上。 5.3.3发病率和病情指数 按照分级标准对小区的发病情况进行调查和记录，计算发病率和病情指数（DI）。 发病率计算方法为：发病率=发病叶数/调查总叶数×100% 病情指数计算方法为： DI=Z（各级级值X该级病叶数）/（调查总数X最高级值）X100 6调查记录 记录鉴定和调查的方法、过程和结果，并存档（见附录D、附录E)。 2 NY/T3862—2021 附录A （规范性） 茶云纹叶枯病 A.1分布与危害 茶云纹叶枯病又称叶枯病，是茶园中最常见的一种叶部病害。在各产茶省（区）均有发生，尤以浙江、 湖北、湖南、云南、广东等省发生较重。除危害茶树外，还危害油茶和山茶。在生长衰弱、台刘茶园以及扦 插苗圃中发病较重。叶片罹病后，光合作用强度明显减弱，呼吸作用增强，病株叶片提早脱落，枝梢回枯， 导致树势衰弱，产量下降，严重时，茶园呈现一片枯褐色。幼龄茶树可致全株枯死。 A.2 症状 主要危害成叶和老叶，也可危害新梢、枝条和果实。叶部病斑多从叶缘或叶尖发生，初为黄褐色水浸 状，半圆形或不规则形，后变褐色，一周后病斑由中央向外渐变灰白色，边缘黄绿色，形成深浅褐色、灰白色 相间的不规则形病斑，并生有波状、云纹状轮纹。后期病斑处生针头状大小的黑点，沿轮纹排列，此为病菌 分生孢子盘。枝条病斑短条状或梭状，稍下陷，绕茎扩展；幼芽染病变黑枯死；果实上形成黄褐色至灰白色 圆形病斑（见图A.1)。 图A.1茶云纹叶枯病发病叶片典型症状 A.3病原形态 病原菌为山茶刺盘孢菌（ColletotrichumcamelliaeMassee），属无性型真菌腔孢纲（Coelomycetes）黑 盘孢自（Melanconiales）刺盘孢属（Colletotrichum）。分生孢子盘浅盘状，宽187um29oum，盘上周生黑 褐色刺状刚毛，刚毛具1个3个隔膜，基部粗，顶端尖钝而色较淡，大小（40～70）μm×（3～5）μm。分生 孢子梗无色，柱状，大小（16～42)μm×（1.5～4.5）μm（见图A.2）。分生孢子长椭圆形，单胞，无色，直或 稍弯，内含1个～2个近透明油球，大小（14～21)μm×（3～6)μm（见图A.2）。附着胞形状不规则，常具浅 裂，棕色到深棕色（见图A.2）。有性态为山茶球腔菌（GuignardiacamelliaeButler），属于子囊菌门（As- comycota）腔菌纲（Loculoascomycetes）座囊菌目（Dothideaceae）座囊菌科（Dothideales）黑腐菌属（Guig nardia），不常见。子囊座球形或扁球形，直径60μm～150μm，黑褐色。子囊棍棒形，顶端圆，基部狭细， 大小为（44～62)μm×（8～12)μm，内含8个子囊孢子，排成二列。子囊孢子纺锤形、椭圆形或卵形，无色， 单胞，常具1个~3个油球，大小为（10~18)μm×（3~6)μm。 A.4病原生物学特性 病原菌的分生孢子萌发的最适温度范围为23℃～29℃，菌丝生长的最适温度范围为27℃～29℃； NY/T3862—2021 标引序号说明： 1——分生孢子梗； 2、3——分生孢子； 4、5——附着胞。 注：标尺指示长度为10um。 图A.2山茶刺盘孢菌病原形态 致死温度为60℃；菌丝生长的最适pH范围为5.2～5.8,孢子萌发的最适pH范围是5.0~6.0；光照对 病菌生长速度及分生孢子萌发影响不大，但对其产孢的影响很大，特别是有光照与无光照处理之间差异显 著，光照有利于分生孢子的形成。 A.5病害循环 病原以菌丝体、分生孢子盘或子囊壳在茶树病叶部或土表落叶中越冬。翌春条件适宜时，越冬分生孢 子盘产生分生孢子或经子囊壳产生子囊孢子，经水浸泡后成熟释放，随风雨传播，由茶树的嫩叶表皮或伤 口侵人，经5d～18d潜育形成新病斑，在新的病斑部位产生新的分生孢子经风雨传播，进行再侵染。 A.6发病规律 云纹叶枯病是一种在高温高湿性条件下适宜发生的病害。适温范围内，温度升高，可以促进病菌的发 育，并缩短潜育期，多雨高湿有利于孢子的形成、传播和萌发侵入，致使病害发展。当平均气温高于20℃、 相对湿度80%时菌丝开始伸展蔓延；气温达到25℃以上时，孢子大量产生。27℃～29℃是病菌发育的 最适宜温度，也是病害传播的盛期。平均气温24℃30℃时潜育期为5d～9d；平均气温20℃～24℃ 时潜育期为10d～13d；平均气温低于16℃时潜育期为13d以上。 NY/T3862—2021 附录B （规范性） 茶云纹叶枯病菌实时荧光定量PCR法鉴定 B.1主要试剂 马铃薯葡萄糖琼脂培养基、液 、Tris-HCI.NaCI.EDTA.CT AB、PVP40、β-琉基乙醇、RNAase-A、 酚、氯仿、异戊醇、异丙醇、乙酒 酸（dNIP）、TaqMan探针、Taq聚合酶、 ddH2O。 D B.2主要设备 实时荧光定量 义 心机、电泳槽、电泳仪 和电子天平等。 B.3样品DNA 提 每个叶片 02g 外 LpH8.0的提 EDT 充 取缓冲液（25 nme 在室温下离心 (12000r/m 加人1 饰热的D mol/L pH 8. 0 Tris-HCl,1. Cl,20mmol/LE VOV 和2%（V/V) β-巯基乙醇（ 现加 水浴 min,其间