ICS 65.020.01 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3859—2021 果品中交链孢霉菌鉴定 技术规程 Technical code of practice for identification of Alternaria Neesinfruits 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3859—2021 全国愉业食品标准 务平台 典通 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化代作导则 第1部分：标准化食件尚站构和起草规则》的规定 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出。 本文件由全国果品标准化技术委员会（SAC/TC510)归口。 本文件起草单位：北京农业质量标准与检测技术研究中心、中国科学院植物研究所 本文件主要起草人：姜冬梅、李博强、冯晓元、王蒙、王刘庆、郭晓军、韩平。 I NY/T3859—2021 果品中交链孢霉菌鉴定技术规程 1范围 本文件规定了鲜食果品中交链孢霉菌（AlternariaNees)的鉴定方法，包括分子生物学法（第一法）和 形态学法（第二法）。 本文件适用于鲜食果品中交链孢霉菌的鉴定 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本义件 文件。 GB4789.16 食品安全 形态学鉴定 Q GB/T6682 分 验室用水 格 GB19489 生物安 通用要 GB/T27403 验室质量 E 制规范 S 3 术语和定义 下列术语和定 适用 本文件 3. 1 R 聚合酶链式反店 polymerase chain reaction,PCR 种用于放 增特定的DNA片段的分子 学技术 喷板DNA序列 温变 单链，适宜的 五补厂 反应条件下，根据 板序列设中的两条引物分 配对结合，在 磷酸NTP 补配 DNA聚合酶的作用 下，以四种脱氧核糖 为反应原料 半保留复制 火和延 原理，合成一条新的 历不断重 ENTEI 这一循环，使目 的DNA片段以几何倍数扩 3. 2 R GenBank数据库 GehBank Database 美国国家生物技术 CBI)建立的DNA序 列数据库。 4 防污染措施 4.1鉴定过程中防污染措施按GB19489GB/T27403中的规定执行 4.2鉴定过程中的含菌废弃物需经121℃高压灭菌处理30min后再弃置。 第一法分子生物学法 5原理 采用聚合酶链式反应(PCR)扩增样品中真菌核糖体基因内转录间隔区（ITS)序列，并对PCR产物进 行序列测定，将测序结果与GenBank数据库中的相关序列进行比对，确定样品中是否存在交链孢霉菌。 6主要试剂 6.1DNA提取溶液（见附录A中的A.1)。 1 NY/T3859—2021 6.2三氯甲烷-异戊醇混合液（24：1)。 6.3Tris-EDTA缓冲液（见附录A中的A.2）。 6.4PCR缓冲液（见附录A中的A.3)。 6.5dNTPs:2.5 mmol/L。 6.6上样缓冲液（见附录A中的A.4)。 6.7TAE缓冲液（见附录A中的A.5)。 6.8DNA分子量标准：可以清楚区分100bp1000bp的DNA片段。 6.9TaqDNA聚合酶。 6.10琼脂糖：电泳纯、 6.11液氮。 6.12无水乙醇。 注：除特殊注明外，本法所用试剂均为分析纯或生化试剂，水为GB/T6682规定的一级水。 7设备和材料 除分子生物学实验室常规灭菌及培养设备外，其他主要设备和材料如下： a）高速冷冻离心机：最大转速≥10000r/min； b) 冰箱：-20℃,2℃~4℃； c）天平：感量0.01g； (p 灭菌锅：最大压力为0.235MPa，可调控范围温度为105℃～135℃； e) 旋涡混匀器：最大转速为2800r/min； D PCR扩增仪：温度范围4℃99℃，控温精度土0.25℃； g） 电泳仪：输出电压5V~600V，输出电流2mA~200mA； h）凝胶成像仪：302nm紫外透照仪、顶置白光光源、白光转换板、UV干涉滤光片、机载头像捕捉软 件、图像分析软件； i) 不锈钢小刀或眼科手术小刀； j）微量可调移液器：2.5μL、10μL、20μL、100μL、200μL、1mL; k）离心管：0.2mL(PCR管）、1.5mL、2mL。 8 鉴定步骤 8.1样品采集与处理 用不锈钢小刀或眼科手术小刀切取果品病症组织约0.3g，用无菌滤纸吸干水分，加液氮研磨，至 粉末状。 8.2基因组DNA的提取 8.2.1将研磨后的样品转人2mL离心管，加入65℃预热的DNA提取溶液900μL，充分混匀，65℃保 温40min~60min，12000r/min离心10min。 8.2.2取上清液转人新的1.5mL离心管中，加入等体积的三氯甲烷-异戊醇混合液抽提10min，12000 r/min离心10min，重复一次。 4℃,12000r/min离心10min。 8.2.4弃上清液，冷70%乙醇洗涤DNA沉淀2次。 8.2.5自然干燥后溶于50uL无菌水或Tris-EDTA缓冲液，制得模板DNA，一20℃冰箱保存备用。 注：基因组DNA也可使用商品化的DNA提取试剂盒提取，具体操作参照试剂盒说明。 8.3PCR反应 2 NY/T3859—2021 8.3.1引物序列 正向引物ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'； 反向引物ITS4：5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3。 8.3.2反应体系 在PCR管中分别加入以下试剂后进行PCR反应：2μL（约200ng）模板DNA，5μLPCR缓冲液， 4μLdNTPs，1μL引物ITS1(10μmol/L），1μL引物ITS4(10μmol/L)和1.25UTaqDNA聚合酶，无 菌水补足至50uL。 注：PCR反应体系的配制也可使用商品化的PCR反应试剂盒，具体操作参照试剂盒说明。 8.3.3反应程序 5 min。 8.3.4产物检测 用TAE缓冲液制备1.5%琼脂糖凝胶（55℃～60℃时加入核酸染料）。取5μLPCR扩增产物，与 1uL上样缓冲液混合，进行点样，同时用DNA分子量标准做参照。3V/cm5V/cm恒压电泳，电泳 20min～40min。将整块琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪观察窗内，根据DNA分子量标准估计扩增条带大 小并拍照保存，见图1。 750 bp 570 bp 500bp 标引序号说明： M DNA分子量标准； 1 阳性样品； PC 阳性对照； 阴性对照 图1PCR产物检测结果电泳图 如果阴性对照未出现扩增片段，待检样品出现与阳性对照相同大小的扩增片段，对待检样品中的扩增 片段进行序列测定，将测序获得的序列与GenBank数据库中的相应序列进行比对分析。 8.4PCR反应体系对照的设置 进行PCR检测时，反应体系应设置阳性对照和阴性对照。阳性对照用交链孢霉菌阳性样品提取的 DNA作为模板，阴性对照中用无菌水作为模板。 8.5ITS序列比对 ITS1/ITS4扩增得到大小约为570bp的片段，测序结果与GenBank数据库中Alternariaspp.菌株 相应序列比对，比对结果显示同源性为99%～100%。 8.6结果判定 ITS序列比对结果与8.5描述相符，可判定样品中存在交链孢霉菌。 8.7样品保存与处理 经鉴定确定携带链格孢霉菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核，保存期满废弃前高压灭菌 处理。 3 NY/T3859—2021 第二法形态学法 9原理 对待检果品中的真菌进行分离纯化后通过显微镜检查（镜检）对真菌的形态特征进行鉴定，确定样品 中是否存在交链孢霉菌。 10培养基和主要试剂 10.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)（见附录A中的A.6)。 10.270%乙醇。 10.31%次氯酸钠溶液 T6682规定的 级水。 11 仪器设备 除微生物实验 至 规灭菌及具 变设备 和材料 a) 生物安 超净工作 柜 效滤膜可除去99.99% b) 恒温 c) 冰箱 d) 显德 e) 不 ) 无菌培 g) 无菌铃 12 鉴定步骤 C 12.1 交链孢霉 菌的分 12.1.1 用 冈小刀 果品 m 央后用水冲洗。 12.1.2置于 钠溶液 中 装消 12.1.3用无菌镊子 央取 豆温培养箱中培养约 72 h。 U 12.1.4从疑似菌落边缘取合 菌丝的PDA 待菌落形成后，再依此 法接种，直至菌落形态典型且无杂菌 12.1.5将纯化后的真菌接种到PDA平板 恒温培养箱中 暗条件下培养5d~7d。 12.2制片及镜检 按GB4789.16中的相关规定 12.3交链孢霉菌形态特征 菌丝细长，分隔。分生孢子梗，通常比菌丝粗而色深，直立单生或成簇，大多不分枝，较短。分生孢子 呈链生或单生，淡褐色至深褐色，形状不一，典型为倒棍形、卵形、倒梨形、椭圆形或近圆柱形，有纵横隔膜， 基部钝圆，顶端延长成喙状，孢子形态及大小各异（见附录B)。 12.4结果判定 真菌形态特征与12.3相符，可判定样品中存在交链孢霉菌。 12.5样品保存与处理 经鉴定确定携带链格孢霉菌的样品应保存于4℃冰箱中，以备复核，保存期满废弃前高压灭菌处理。 4 NY/T3859—2021 附录A (规范性） 主要试剂和PDA的配制 A.1DNA提取溶液 2%十六烷基三甲基溴化铵（CTAB)，1.4mmol/L氯化钠（NaCl)，100mmol/L三羟甲基氨基甲烷 盐酸（Tris-HCI），20mmol/L乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2），pH8.0，使用前加入0.1%