ICS 65.020.01 CCS B 16 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3855—2021 小麦孢囊线虫检测技术规程 Technical code of practice for detection of wheat cyst nematodes 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部 5发布 NY/T 3855—2021 全国业食昌标准 公共服务平台 典通 本文件按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院植物保护研究所。 本文件起草人：彭德良、彭焕、黄文坤、孔令安。 I NY/T3855—2021 小麦孢囊线虫检测技术规程 1范围 本文件规定了小麦孢囊线虫检测的术语和定义、试剂和设备、样本采集和分离、分子检测方法、结果判 定、样品保存。 本文件适用于小麦禾谷孢囊线虫（Heteroder ae）和菲利普孢囊线虫（Heteroderafilipjevi）的 分子检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通 其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于 文件容 文件。 GB/T6682 分析 实验室用水 规格 机试验方法 RESE NY/T3533 麦抱线 小 虫鉴定和监测技术规程 SN/T2757 植 SEARCH 3术语和定义 NY/T3533 4试剂和设备 4.1主要试齐 4.1.1通用要求： 实验用试剂均 6682中一级水的 规定。 4.1.2 蛋白酶K 谷 液 4.1.310XPCR 4.1.4TaqDNA 4.1.5dNTPs:dATP 4. 1.6 琼脂糖凝胶：1.5 4. 1.7 1XTAE缓冲液 4.1.8核酸染料。 4.2主要设备 4. 2.1 标准网筛：孔径分别为0.025mm、0.18mm和0.85mm。 4.2.2 生物显微镜：40倍1000倍。 4.2.3 体视显微镜：10倍～120倍。 4.2.4可调量程移液器：2.5μL、10μL、100μL、200μL和1000μL。 4.2.5 凝胶成像系统。 4.2.6电泳仪。 4.2.7 水平电泳槽。 4.2.8高速台式离心机。 4.2.9PCR仪。 1 NY/T3855—2021 5样本采集和分离 5.1样本采集 按NY/T3533的规定执行。 5.2线虫分离 分离样品中的二龄幼虫和孢囊。分离方法参见NY/T3533一2020中附录B。 6分子检测 6.1线虫DNA提取 按附录A的规定执行。 6.2检测方法 6.2.1方法 采用常规PCR技术。 6.2.2引物 HaR1为 5'-GAGGGGGTGGGAATGAAATGGAT-3'。 菲利普孢囊线虫的正向引物HfF1为5'-CAGGACGAAACTCATTCAACCAA-3'，反向引物HfR1 为5'-AGGGCGAACAGGAGAAGATTAGA-3'。 引物溶液浓度均为10μmol/L。 6.3反应体系 在设定的PCR管中加人10×PCR缓冲液2.5μL，TaqDNA聚合酶0.5μL,正向引物和反向引物 各0.5μL,dNTPs2μL,待测样品的DNA模板1μuL，用ddHzO补至25μL。阴性对照用ddHzO代替 DNA模板。 6.4反应程序 95℃预变性5min；95℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸1min，共35个循环；72℃延伸10min。 程序结束后，PCR产物置于4℃保存。 6.5琼脂糖凝胶电泳检测 取10μLPCR产物在琼脂糖凝胶上电泳分离，经核酸染料染色后，在凝胶成像系统下观察。 7结果判定 阴性对照未出现条带，待测样品出现646bp条带判定检出菲利普孢囊线虫，待测样品出现1010bp 条带判定检出禾谷孢囊线虫。结果判读见附录B。待测样品首次检测结果为阴性的，重复检测一次，两次 检测均为阴性时，待测样品判定为阴性。 8样本保存 田间采集的剩余样本应放置于4℃保存至少6个月，以备复检， 2 NY/T3855—2021 附录A (规范性） 线虫DNA提取 A.1在0.2mLPCR管中加10μL灭菌ddHzO挑入单个孢囊或单条二龄幼虫，置于液氮中冷冻 Imin。 A.2将PCR管置于冰上，用消毒玻璃棒将线虫磨碎。 A.3将PCR管置于液氮中冷冻1min，再重复A.2。 A.4PCR管中加人8μL的10XPCR缓冲液，2μL蛋白酶K溶液，置于一80℃下冷冻2h。 A. 5 5将PCR管取出，65℃下温育1.5h，然后95℃10min，10000r/min离心1min A. 6 取上清液于一20℃保存备用。 3 NY/T 3855—2021 附录B （资料性） PCR检测结果判读 琼脂糖电泳分离完成后，采用HfF1和HfR1引物从待测样品（1～4泳道)扩增出646bp条带、阴性 对照(5泳道)未出现条带时，判定待测样品检出菲利普孢囊线虫，其结果如图B.1所示；采用HaF1和 HaR1引物从待测样品（613泳道）扩增出现1010bp条带、而阴性对照（14泳道）未出现条带时，判定待 测样品检出禾谷孢囊线虫，其结果如图B 1000b 500b PCR分子检测结 7501 500bp 标引序号说明： M D2000DNA分子量标准； 6~13 待测样品； 14 阴性对照。 图B.2禾谷孢囊线虫PCR分子检测结果 NY/T 3855-2021 全国农业食品标准 备平台 NY/T3855—2021 ? * * 中国农业出版社出版 （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行 各地新华书店经销 * * * 开本880mm×1230mm1/16 印张0.75 字数15千字 2021年10月第1版 2021年10月北京第1次印刷 书号：16109·8712 定价：24.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3855-2021 举报电话：（010）59194261