ICS 65.100 CCS B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3854—2021 看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 Technical code of practice for detection the target-site resistance of Alopecurus aequalis Sobol. to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibiting herbicides 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3854—2021 全国业食昌标准 共服务平台 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院植物保护研究所。 本文件主要起草人：崔海兰、李香菊、陈景超、李政、彭立存、郭小桐。 PUBLI NY/T3854—2021 看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂 靶标抗性检测技术规程 1范围 本文件规定了看麦娘（AlopecurusaequalisSobol.）对乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-coenzymeAcar boxylase，ACCase)抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程的基本要求及注意事项。 本文件适用于看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂产生靶标抗性的有关检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单)适用于本文件。 NY/T1667—2008农药登记管理术语 NY/T1859.72014农药抗性风险评估第7部分：抑制乙酰辅酶A羧化酶除草剂抗性风险评估 NY/T3287—2018日本看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 3术语和定义 NY/T1667—2008、NY/T1859.7—2014、NY/T3287—2018界定的术语和定义适用于本文件。 4检测程序 4.1材料培养 选择无看麦娘种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%～30%的草炭土，混合均匀后装入直径不 小于10cm的培养钵；待测种群及敏感对照种子分别定量均匀撒播在土壤表面，覆土约1cm，采用盆钵底 部渗灌方式补充水分，土壤相对湿度保持在60%～70%；置于25℃：15℃（D：N），光周期12h：12h （L：D)条件下培养。待看麦娘长至2叶1心期，间苗，每盆保留长势一致的10株。 4.2生物测定 待植株长至3叶1心期，用待测除草剂（ACCase抑制剂类除草剂)进行茎叶喷雾处理，药剂处理至少 设置5个剂量，每个剂量不少于4次重复，每个重复10株。施药21d后，调查每个处理的存活植株数、地 上部分鲜重或干重，按公式(1)计算杂草株防效、鲜重或干重抑制率。 M. Y: X100.... Mo 式中： 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%）； M- 除草剂有效剂量Xga.i./hm²处理后存活植株数、地上部分鲜重或干重的数值，单位为株或 克（g）； M。 对照总株数、地上部分鲜重或干重的数值，单位为株或克（g）。 以杂草株防效、鲜重或干重抑制率为指标，按公式（2)计算生长抑制中量。 D-C (2) 式中： Y 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%）； c Y值下限，单位为百分号（%）； D Y值上限，单位为百分号（%）； 1 NY/T3854—2021 X 除草剂有效剂量的数值，单位为克每公项（ga.i./hm"）； GR50 一生长抑制中量的数值，单位为克每公顷（ga.i./hm"）； 斜率。 按公式(3)计算抗药性倍数RI。 GR 50R RI GRs0s ...(3) 式中： RI 抗药性倍数； GR50R 抗药性种群生长抑制中量的数值，单位为克每公项（ga.i./hm）； 敏感性种群生长抑制中量的数值，单位为克每公顷（ga.i./hm²）。 4.3靶标基因检测 4.3.1DNA提取 PUBL 取杂草幼嫩叶片 约200 mg,用甲 每个抗药性种群随机检测抗药性植株不少 用1%琼脂 永 出现 一条清晰明亮的条带，表明DNA 较完整，无降解 DNA样品 度及浓度检测：用分光光度 计测定DNA容液在 的吸光值（OD260）。OD260 等于1时，样 DU浓 度为50m 式计维NA浓度 :(4) 式中： A CDNA DNA 度的数值单位为微 g/mL); OD260 DNA 处的吸光值； A 稀释倍类 通过测定 ONA泽 nm 金测DN 纯度，OD260/OD280 在1.7~2. 间， 经过电 和吸光度检测.质量和纯度符合要求的了 检测 NN 4.3.2聚合酶链式反应(PCR) 用下列引 正向引物 CCCAGCGGCAGA CAGAT-3'，反向 物贝 TCC GTCTTG 为1437bp。也可参照 GenBank登记的看麦娘贪体型 宝列CenBank的登记 设计引物扩增靶标基因 序列。 PCR反应体系如下 mmol/T的dNTP混合液210×PCR Buffer2.5uL,10μmol/L的引物 各0.5μL，5U/μL的Tag DNA聚合酶0. L，提取的待测DNA 样品1u，加人18μ无菌蒸馏水至 反应体系为25μL。PCR反应条件如下.95℃加热5min使DNA裂解变性；进人反应循环，在每一个循 5min，使产物延伸完整。上述引物的退火温度为56℃。 PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，与DNA分子量标准品比对，判断产物片段大小与预期是 否相符，根据条带亮度和有无杂带，判断产物浓度和扩增特异性。 4.3.3PCR产物测序 PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯化 后的PCR产物测序，测序引物采用扩增目的片段的引物。 5结果分析 5.1剂量反应曲线结果分析 2 NY/T3854—2021 及GR50，判断是否产生抗药性及抗药性植株所占比例，根据计算的RI判断抗药性水平高低。 5.2靶标基因检测结果分析 测序结果首先用软件查看测序峰图，根据测序峰图是否正常、有无杂峰等来判断测序结果是否可用。 测序的碱基序列翻译成氨基酸序列，并与大穗看麦娘（AlopecurusmyosuroidesHuds.）（GenBank上的登 记号为AJ310767)和看麦娘（GenBank上的登记号为KX571249)的ACCase氨基酸序列进行比对，分析靶 标酶氨基酸发生取代的位点。 日前在抗ACCase抑制剂类除草剂的杂草中发现有7个位点氨基酸被取代与抗药性有关，分别是， 1781位异亮氨酸被亮氨酸/缬氨酸/苏氨酸取代；1999位色氨酸被半胱氨酸/亮氨酸/丝氨酸取代；2027位 色氨酸被半胱氨酸取代；2041位异亮氨酸被天冬酰胺/缬氨酸取代；2078位天冬氨酸被甘氨酸取代；2088 5.3抗药性判断 如果检测结果中5.1和5.2均满足条件，即判断为靶标抗性。 6注意事项 a) 剂量反应曲线法中除草剂剂量的设置，应根据预实验来确定，敏感和抗药性种群的剂量可以不完 全一致； b）PCR反应体系和反应条件，因所使用试剂和仪器的不同而有所差异，需要前期预备试验摸索适 合各自实验室的最佳条件； c) 碱基，因此，如果只看序列文件，会出现假阴性结果，测序结果要以测序峰图为准； d) 随着抗药性机理研究的深人，需要根据最新研究结果来判断结果。 典拿 3 NY/T 3854—2021 全国农业食品标准 公共服业标准 看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 NY/T3854—2021 * （北京市朝阳区麦主店街） 18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行 各地新华书店经销 * * * 开本880mmX1230mm1/16 印张0.5 字数10千字 2021年10月第1版 2021年10月北京第1次印刷 书号：16109：8711 定价：16.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3854-2021 举报电话：（010）59194261 NY/T 3854—2021 全国农业食品标准 公共服业标准 看麦娘对乙酰辅酶A羧化酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 NY/T3854—2021 * （北京市朝阳区麦主店街） 18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行 各地新华书店经销 * * * 开本880mmX1230mm1/16 印张0.5 字数10千字 2021年10月第1版 2021年10月北京第1次印刷 书号：16109：8711 定价：16.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3854-2021 举报电话：（010）59194261