ICS65.100 CCS B 17 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T3853—2021 猪殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 Technical code of practice for detection the target-site resistance of Galium spurium Linn. to acetolactate synthase inhibiting herbicides 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T3853—2021 全国农前食品标准 公共服务平台 本文件按照GB/T1.1-2020《 标准化工作导则 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院植物保护研究所 本文件主要起草人：崔海兰、李香菊、陈景超、李政、彭立存、郭小桐 PUBLI NY/T3853—2021 猪殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 1范围 本文件规定了猪殃殃（GaliumspuriumLinn.）[异名GaliumaparineLinn.var.tenerumGren.et (Godr.）Rebb.对乙酰乳酸合成酶（acetolactatesynthase，ALS)抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 的基本要求以及注意事项。 本文件适用于猪殃殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂产生靶标抗性的有关检测。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 NY/T1667—2008农药登记管理术语 NY/T1859.4农药抗性风险评估第4部分：乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂抗性风险评估 NY/T3285—2018播娘蒿对乙酰乳酸合成酶抑制剂类除草剂靶标抗性检测技术规程 3术语和定义 上述引用文件中界定的术语和定义适用于本文件。 4 检测程序 4.1材料培养 选择无猪殃殃种子、无除草剂残留的农田地表土，混合20%～30%的草炭土，混合均匀后装入直径不 小于10cm的培养钵；待测种群及敏感对照种子用0.05%～0.1%的赤霉素溶液浸泡12h24h后冲洗 干净（或其他打破休眠处理），均匀撒播在土壤表面，覆土约1cm，采用盆钵底部渗灌方式补充水分，土壤 相对湿度保持在60%～70%；置于25℃：15℃（D：N)，光周期12h：12h(L：D）条件下培养。待猪殃 殃长至2叶期，间苗，每盆保留长势一致的10株。 4.2生物测定 个剂量，每个剂量不少于4次重复，每个重复10株。施药21d后，调查每个处理的存活植株数、地上部分 鲜重或干重，按公式(1)计算杂草株防效、鲜重或干重抑制率。 Y: X100 M。 (1) 式中： Y 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%）： M除草剂有效剂量Xga.i./hm²处理后存活植株数、地上部分鲜重或干重的数值，单位为株或 克(g)； M。 对照总株数、地上部分鲜重或干重的数值，单位为株或克（g）。 以杂草株防效、鲜重或干重抑制率为指标，按公式(2)计算生长抑制中量。 D-C Y=C+: 1+(X/ GR50) 式中： Y 株防效、鲜重或干重抑制率，单位为百分号（%）； 1 NY/T3853—2021 c Y值下限，单位为百分号（%）； D Y值上限，单位为百分号（%）； X 除草剂有效剂量的数值，单位为克每公顷（ga.i./hm²）； GR50 生长抑制中量的数值，单位为克每公顷（ga.i./hm"）； b 斜率。 按公式(3)计算抗药性倍数RI。 GR50R RI= GR50S (3) 式中： RI 抗药性倍数： GR50R 抗药性种群生 长抑制中量的数值，单位为 克每公项（ga /hm²); GRs0s 敏感性种群生长抑制中量的数值单B为克每公 4.3靶标基因检测 4.3.1DNA提取 取杂草幼嫩 性植株 秒于10株，并单株检 用1%琼脂糖液 凝胶电泳 金测提取 DNA质量 香合格 电泳出 条滑晰 斤明亮的条带，表明DNA S S 较完整，无降解 DNA样品的 纯度及浓度检测：用分光光度计测定DA浴液在260m 处丽吸 (OD260)。OD260 ARCH 等于1时，样品 DA 计镜TNA浓度 URA C OD 2AX50 ..(4) 式中： CDNA ONA浓 度：单位为微克每毫升 mL); OD260 DNA溶 A 稀释倍 通过测定 A浴液在 和280处的吸光值（OD 度，OD260/OD280 LTU 在1.7~2.0之间， 表明DNA 经过电泳和 量和纯度符合要求的DNA样品可用丁后 4.3.2聚合酶链 式反应(PCR) 用引物对：5'-A TCC GTAATC-3'，特异性扩 增猪殃ALS，扩增 段大小为 1908bp，或根据 已知猪殃殃ALS 创（GenBank上的登记号为 GU377313)设计特异性引物 PCR反应体系如下：2.5mmol/ /L的dNTP混合液2μL,10XPCRBuffer2.5μL,10μmol/L的引物 各0.5uL，5U/uL的TaqDNA聚合酶0.5 提取的待测DNA样品1uL，加入18μL无菌蒸馏水至反 应体系为25μL。PCR反应条件如下：95℃加热 hin，使DNA裂解变性；进人反应循环，在每一个循环 中，95℃裂解30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，共30个循环；最后72℃延伸5min，使产物延伸完整。 PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，与DNA分子量标准品比对，判断产物片段大小与预期是 否相符，根据条带亮度和有无杂带，判断产物浓度和扩增特异性。 4.3.3PCR产物测序 PCR产物的电泳检测结果符合预期时，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒对产物进行回收纯化，纯化 后的PCR产物测序，测序引物采用扩增目的片段的引物。 5结果分析 5.1剂量反应曲线结果分析 2 NY/T3853—2021 除草剂处理后21d调查各剂量下的存活杂草株数、地上部分鲜重或干重，根据在各剂量下的存活率 及GR50，判断是否产生抗药性及抗药性植株所占比例，根据计算的RI判断抗药性水平高低， 5.2靶标基因检测结果分析 测序结果首先用软件查看测序峰图，根据测序峰图是否正常、有无杂峰等来判断测序结果是否可用。 测序的碱基序列翻译成氨基酸序列，并与拟南芥[Arabidopsisthaliana（Linn.）Heynh]（GenBank上的 登记号为AY042819.1)和猪殃殃（在GenBank上的登记号为GU377313)的ALS氨基酸序列进行比对， 分析靶标酶氨基酸发生取代的位点。 酸/酪氨酸取代；197位脯氨酸被丙氨酸/精氨酸/天冬酰胺/谷氨酰胺/谷氨酸/组氨酸/异亮氨酸/亮氨酸/ 苏氨酸/蛋氨酸/赖氨酸/色氨酸取代；205位丙氨酸被缬氨酸/苯丙氨酸取代；376位天冬氨酸被谷氨酸取 代；377位精氨酸被组氨酸取代；574位色氨酸被亮氨酸/甘氨酸/精氨酸取代；653位丝氨酸被苏氨酸/天 冬酰胺/异亮氨酸取代；654位甘氨酸被天冬氨酸/谷氨酸取代（ALS氨基酸序列以拟南芥为参照）。 5.3抗药性判断 如果检测结果中5.1和5.2均满足条件，即判断为靶标抗性。 6注意事项 a）剂量反应曲线法中除草剂剂量的设置，应根据预实验来确定，敏感和抗药性种群的剂量可以不完 全一致； b) PCR反应体系和反应条件，因所使用试剂和仪器的不同而有所差异，需要前期预备试验摸索适 合各自实验室的最佳条件； c） 由于杂合体的存在，在测序峰图中会出现套峰，但在序列文件中只会显示信号相对更强的那一个 碱基，因此，如果只看序列文件，会出现假阴性结果，测序结果要以测序峰图为准； (P 随着抗药性机理研究的深入，需要根据最新研究结果来判断结果。 典食 3 NY/T 3853-2021 全国农业食品标准 平台 猪殃殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 NY/T3853—2021 * （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 * * * 开本880mm×1230mm1/16 印张0.5 字数10千字 2021年10月第1版 2021年10月北京第1次印刷 书号：16109：8710 定价：16.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3853-2021 举报电话：（010）59194261 NY/T 3853-2021 全国农业食品标准 平台 猪殃殃对乙酰乳酸合成酶抑制剂类 除草剂靶标抗性检测技术规程 NY/T3853—2021 * （北京市朝阳区麦子店街18号楼） （邮政编码：100125 网址：www.ccap.com.cn) 北京印刷一厂印刷 新华书店北京发行所发行各地新华书店经销 * * * 开本880mm×1230mm1/16 印张0.5 字数10千字 2021年10月第1版 2021年10月北京第1次印刷 书号：16109：8710 定价：16.00元 版权专有 侵权必究 NY/T3853-2021 举报电话：（010）59194261