ICS 65.080 CCS B 10 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3833—2021 微生物肥料菌种保藏技术规范 Technical specification of culture preservation for microbial fertilizers 2021-05-07发布 2021-11-01实施 中华人民共和国农业农村部发布 NY/T 3833—2021 平台 前 本文件按照GB/T1.1一2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定 起草。 本文件由农业农村部种植业管理司提出并归口。 本文件起草单位：中国农业科学院农业资源与农业区划研究所、中国农业微生物菌种保藏管理中心。 本文件主要起草人：李世贵、顾金刚、马晓彤、邓晖、张晓霞。 1 NY/T3833—2021 微生物肥料菌种保藏技术规范 1范围 本文件规定了微生物肥料菌种保藏的术语和定义、基本原则、技术要求和技术方法。 本文件适用于微生物肥料生产和研究的菌种保藏。 2规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款 其中，注日期的引用文件，仅 该日期对应的版本适用于本文件 手：不注日期的引用文代具新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 NY/T1113—2006 NY/T18472010 微生物肥料生产菌株质量评 3术语和定义 NY/T1113 1847 生界定的以 下列语和定 3. 1 S 微生物肥料 microbial fertilizer 含有特定微 肥料制品 应用手农业生产 命活 加植物养分 供应或促进植物 量改善衣产品品质及衣业生态环境。 注：日前，微生物肥料包含 生物接种剂、复合微生物肥料和生物有机肥 ［来源：NY 2010,3. 3. 2 菌种保藏 ion 使菌种保持 力固有的遗传和牛理生化特性，以及形， 态特征的微生 ［来源：NY/T 3.3 定期移植法 将菌种接种于适宜的培养基，在最适 虾培养 至稳定期后于生 保存，并间隔一定时 间进行移植培养。 注：亦称传代培养保藏法，包括斜面培养、穿刺培养和液体培养等 3. 4 液体石蜡保藏法 liquidparaffinpreservationmethod 覆盖整个斜面，再直立放置于4℃～6℃低温或室温干燥环境进行保存。 3.5 沙土管保藏法sand-soilpipepreservationmethod 将培养好的菌种用无菌水制成菌悬液或孢子悬液，滴人灭菌的沙土管中混合均勾，或直接将成熟孢子 刮下混于灭菌的沙土管中，使其吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后，熔封管口或石蜡密封管口后置干 燥器中，置于4℃～6℃低温或室温保存。 3.6 冷冻干燥保藏法freeze-dryingpreservationmethod 将欲保藏的菌种加入保护剂制成菌悬液后，分装于安颜管中冻结，然后在减压条件下利用升华现象除 1 NY/T3833—2021 去水分，达到真空干燥后，熔封管口，放置于4℃～6℃低温保存。 3.7 低温冻结保藏法 cryopreservationmethod 3.8 液氮超低温保藏法liquidnitrogencryopreservationmethod 4基本原则 4.1使用的微生物肥料菌种应安全、有效，生产者应提供菌种的分类鉴定报告，包括属及种的学名、形态、 生理生化特性及鉴定依据等完整资料，以及菌种安全性评价资料。采用生物工程菌，应获准允许大面积释 放的生物安全性有关批文。 4.2针对特定的微生物肥料菌种应选择适宜的保藏方法，保持菌种的原有性状，避免菌种死亡、退化、变 异或污染。 4.3菌种保藏环境应相对独立和洁净，避免菌种间的交叉污染。 4.4菌种保藏应符合环境保护要求，不应对周围环境造成污染和危害。 4.5菌种宜采用2种以上的保藏方法进行保存。不同类别微生物肥料菌种适宜采用的菌种保藏方法及 保藏时间见表1。 表1 不同类别微生物肥料菌种适宜采用的菌种保藏方法及保藏时间 序号 保藏方法 保藏时间 适用菌种类别 1 定期移植法 3个月～6个月 细菌、放线菌、酵母菌、真菌等各类微生物肥料菌种 2 液体石蜡保藏法 2年～3年 不能分解液体石蜡的细菌、放线菌、酵母菌和丝状真菌等微生物肥料菌种 3 沙土管保藏法 2年～10年 芽孢杆菌、产孢放线菌以及产孢真菌等微生物肥料菌种 4 冷冻干燥保藏法 5年～20年 大多数细菌、放线菌、酵母菌和部分丝状真菌等微生物肥料菌种 5 低温冻结保藏法 2年～5年 细菌、放线菌、酵母菌、真菌等各类微生物肥料菌种 6 液氮超低温保藏法 20年以上 细菌、放线菌、酵母菌、真菌等各类微生物肥料菌种 5技术要求 5.1菌种保藏需选择合适的培养基，可参考《中国菌种目录》和NY/T1114及NY/T2321。 5.2菌种保藏过程中应注意无菌操作，避免污染。 5.3菌种保藏时应做好标记，标明菌种编号、菌种名称和保藏日期等信息。 5.4菌种培养至稳定期或产生成熟孢子后进行保藏。 6技术方法 6.1定期移植法 6.1.1适用范围 本方法适用于细菌、放线菌、酵母菌、真菌等各类微生物肥料菌种的短期保藏。 6.1.2原理 低温可减缓菌种的代谢活动，抑制其生长繁殖速度，减少菌株变异、延长菌种保藏的时间。通过定期 移植，保持菌种活力，避免菌种大量死亡等。 6.1.3操作步骤 按照附录A的规定执行。 2 NY/T3833—2021 6.2液体石蜡保藏法 6.2.1适用范围 本方法适用于不能分解液体石蜡的细菌（如芽孢杆菌属、醋酸杆菌属等）、放线菌、酵母菌和丝状真菌 （如青霉属、曲霉属等）。 6.2.2原理 在液体石蜡覆盖下，隔绝了空气，使菌种的生长代谢受到抑制。此方法也可防止因培养基的水分蒸发 而引起的菌体死亡，延长菌种保藏时间。 6.2.3操作步骤 按照附录B的规定执行。 6.3沙土管保藏法 6.3.1适用范围 本方法适用于芽孢杆菌 6.3.2原理 繁殖速度受到抑制，延 6.3.3操作步骤 按照附录C的规定 执 6.4冷冻干燥保藏法 6.4.1适用范图 本方法适用 广放线菌酵再种部分丝状真菌等微生物肥料菌禾 6.4.2原理 微生物细胞在 生下中手发生“升华”脱水细胞的生理代谢活动 在真空干燥条 件下，菌种得以 山 6.4.3操作步骤 按照附录D 6.5低温冻结保藏 R 6.5.1适用范围 微线销 本方法适用于细菌 6.5.2原理 人 低温冻结条件可减缓微生物细胞的新陈低 6.5.3操作步骤 按照附录E的规定执行。 6.6液氮超低温保藏法 6.6.1适用范围 本方法适用于细菌、放线菌、酵母菌、真菌等各类微生物肥料菌种。 6.6.2原理 在一130℃以下微生物细胞的新陈代谢趋于停止，以达到长期、有效地保藏。 6.6.3操作步骤 按照附录F的规定执行。 3 NY/T3833—2021 附录A （规范性） 定期移植法 A.1培养基制备 A.1.1器血准备 培养基制备过程中所用的器皿，如锥形瓶、试管、烧杯、吸管等，经充分洗涤、干燥后使用。 A.1.2培养基配制 A.1.2.1原料称量与溶解 先在烧杯或糖瓷缸中放适量水，按培养基配方称取各项原料，依次将营养成分、缓冲化合物和微量元 素等加人水中溶解，搅拌均匀，最后补足水量。 A.1.2.2调pH 配料溶解后冷却至室温，根据要求加稀酸(0.1mol/L的HCI)或稀碱(1%的NaOH)调pH。加酸或 碱液时要缓慢、少量、多次搅拌，防止局部过碱或过酸而导致测量不准确和营养成分被破坏。 A.1.2.3加凝固剂 配制固体培养基和半固体培养基时需加凝固剂，常用的凝固剂是琼脂。固体培养基的琼脂用量一般 养基后，加热并不断搅拌至融解，再补足蒸发水分。 A.1.2.4分装 配好的培养基应趁热分装。斜面培养基分装量约为试管高度的1/4,穿刺培养基的分装量宜为试管 高度的1/3～1/2，液体培养基分装量宜为试管高度的1/4～1/3或锥形瓶容量的1/3～1/2。分装过程中 勿使培养基沾污管口或瓶口，以免造成污染。 A.1.2.5包扎标记 管口或瓶口加棉塞或胶塞，外面包扎防潮纸（如牛皮纸或铝箔等)，注明培养基名称及配制日期 A.1.3灭菌 按要求将培养基灭菌，通常为121℃高压蒸汽灭菌30min。含糖的培养基，采用115℃高压蒸汽灭 菌30min，防止糖的成分遭到破坏。如果培养基中的某些成分不耐高温，可用过滤除菌的方式单独除菌 后，再加入灭菌的培养基中。 A.1.4斜面摆放 分装试管的固体培养基灭菌后应及时摆放斜面，斜面长度不宜超过试管管长的1/2。 A.1.5无菌检查 将灭菌的培养基放人培养箱中，37℃培养1d～3d。无菌检查合格后将其保存于4℃备用。菌种保 藏用的斜面培养基应尽快使用。 A.2接种 A.2.1斜面接种 A.2.1.1点接 把菌种点接在斜面中部偏下方处。此方法适用于扩散型生长的丝状真菌。 A.2.1.2划线法 从斜面底部中央自下而上划一直线或“之”字形划线。此方法适用于细菌、放线菌和酵母菌。 4 NY/T3833—2021 A.2.2穿刺接种 用接种针挑取少量菌体，从柱状培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿 刺途径慢慢抽出接种针。此方法适用于乳酸菌和酵母菌。 A.2.3液体接种 用接种环挑取少量菌种或用无菌吸管或滴管等取菌悬液接种于液体培养基中。 A.3培养 将接种后的培养基，置于菌种培养所要求的适宜温度下培养至稳定期或产生成熟的孢子。 A.4保藏 培养好的菌种于4℃～6℃低温保存。保藏湿度用相对湿度表示，不宜超过50%～70%。 A.5恢复培养 RD 定期移植恢复培养的间隔 5 ·将保藏菌种