ICS 65.120 B 46 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3803—2020 饲料中37种霉菌毒素的测定 液相色谱一串联质谱法 Determinationof 37mycotoxins infeeds- Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) 2020-11-12 发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T3803—2020 言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国饲料工业标准化技术委员会（SAC/TC76)归口。 （北京）]。 本标准主要起草人：苏晓鸥、王瑞国、王培龙、林刚、张志岐、武爱波 I NY/T3803—2020 饲料中37种霉菌毒素的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了饲料中37种霉菌毒素的液相色谱-串联质谱筛选检测方法 本标准所测定的霉菌毒素名称、分组和 方法的检出限见附 2规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是 人 仅注口 1期的版本适用于本文件 凡是不注日期的引用文 新版本包 GB/T6682 分 实马 用水 G GB/T20195 动物 料 3原理 试样中的霉菌毒 日色 谱-串联质谱仪 JRAL 检测。 试剂或材料 除非另有 4.1水:GB/T 4.2乙睛：色请 U 4.3甲酸：色谱 4.4乙酸铵：色 4.5 甲醇：色谱纯 4.6 霉菌毒素标准 4.7 乙睛-甲醇溶液： 50- 4. 8 提取液：量取159ml 840ml 甲酸（4.3），混匀 4. 9 乙酸铵溶液（100mmol 准确称取 开稀释至100mL，混勺匀。 4.10 流动相A：准确吸取1mL甲酸（ 1.3）和1mL乙酸铵溶液（4.9）.用水稀释并定容至1000mL， 混匀。 4.11流动相B：量取900mL甲醇（4.5)于1000ml容量瓶中，准确加入1mL甲酸（4.3）,用水稀释至 刻度，混匀。 4.12各组的混合标准储备溶液（100ug/mL）：按照附录A的分组称取适量的标准品，置于10mL容量 瓶中，A组和B组用乙睛（4.2)，C组用乙睛-甲醇溶液（4.7)溶解、定容。于一18℃下避光保存，有效期为 12个月。 4.13各组的混合标准中间溶液（4ug/mL）：分别准确移取400μL各组的混合标准储备溶液（4.12)置于 10mL容量瓶中，用乙睛（4.2)定容，混匀。于一18℃以下避光保存，有效期为6个月。 4.14全混合标准系列工作溶液：分别准确移取适量的各组的混合标准中间溶液（4.13），用乙睛配制 成全混合标准系列溶液，其中A组待测物浓度分别为0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mlL、 50ng/ml和100ng/mL；B组待测物浓度为5ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、200ng/mL、500ng/mL和 NY/T3803—2020 1000ng/mL;C组为10ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL和2000ng/mL。临 用现配。 4.15多重基质吸附型固相萃取柱：MLJ-1>，0.4g/2.5mL。 4.16微孔滤膜：0.22μm，有机系。 5仪器设备 5.1超高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI)。 5.2涡旋混合器。 5.3振荡器。 5.4离心机：转速不低于8000r/min。 5.5真空浓缩仪或氮吹仪。 5.6分析天平：感量0.0001g和0.00001g。 5.7天平：感量0.01g。 6样品 按GB/T20195制备样品，至少500g，粉碎使其全部通过0.42mm孔径分样筛，充分混勾，装入磨口 瓶中，立即检测。如果需要较长时间保存，应将样品密封后于一18℃以下保存，以免样品在保存过程中产 生新的霉菌毒素。选取类型相同、均匀一致，且在待测物保留时间处仪器响应值小于方法检出限30%的 饲料样品作为空白样品。 7试验步骤 7.1提取 平行做2份试验。称取5g（精确至0.01g）试样于50mL离心管中，准确加入20mL提取液（4.8）， 涡旋混匀，振荡提取20min，于8000r/min离心5min，立即移取上清液，备用。 7.2净化 将微孔滤膜（4.16)连接到多重基质吸附型固相萃取柱（4.15)的出口端，准确移取1mL上清液（7.1) 加载到上述萃取柱（4.15)上，过柱速度保持在约1滴/s，收集全部滤液于进样小瓶中，待测。 7.3基质匹配混合标准系列溶液的制备 取空白样品，按7.1提取得到空白基质提取溶液。分别准确移取1mL的全混合标准系列工作溶液 （4.14)，于60℃真空浓缩或氮吹至近干，分别加人1mL空白样品提取溶液，涡旋混匀。再按7.2净化，得到 基质匹配混合标准系列溶液，其中A组待测物浓度为0.5ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、20ng/mL、 1000ng/mL；C组待测物浓度为10ng/mL、40ng/mL、100ng/mL、400ng/mL、1000ng/mL和 2 000 ng/ml。 7.4标准加入法试样溶液的制备 如果无法得到理想的空白样品，则需用标准加人法处理、测定。即，先从全混合标准系列工作溶液选 至近干，分别加入1mL试样提取溶液（7.1)，涡旋混匀，然后另取一份1mL试样提取溶液，再分别按7.2 处理，得到3份待测试样溶液。 7.5测定 7.5.1超高效液相色谱参考条件 1）MLJ-1多重基质吸附型固相萃取柱是北京六角体科技发展有限公司提供的产品的商品名，给出这一信息是为了方 便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可，如果有其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 NY/T3803—2020 色谱柱：Clg柱，柱长100mm，内径2.1mm，粒径1.7um1.8μm，或性能相当者。 柱温：40℃。 流速：0.3mL/min。 进样量：0.5μL 流动相：梯度洗脱程序见表1。 表1梯度洗脱程序 时间 A B min % % 0 5 2 5 4 20 95 12. 1 66 13 66 13. 5 16 7.5.2质谱参考条件 电离方式： 喷 雾电离 检测方式： MRM) 毛细管电 VESI 5kv. 离子源温厂 50℃ 脱溶剂温 脱溶剂气： C 多反应监测（ RM) 7.5.3基质匹配混 合标准 在仪器的最佳 标 准加人法得到的 3个溶液（7.4)上机测定 图参见附 Ca 7.5.4定性 在相同试验条件下 ·试车浴液 测物的保留时间与基质匹配混合 标准系 液中对应待测物的保 留时间偏差应在土2.5% 且试样溶液中待测物的 性离子的相对丰度与 接近的混合基质匹配标 准系列溶液中对应待测物的性离子的相对 美相比 交若偏差不超过表 定的范围，则可判定样品中 存在对应的待测物。 表2 定性测定时相对离子丰度的最大 允许偏差 单位为百分号 相对离子丰度 >50 >20~50 >10~20 ≤10 最大允许偏差 ±20 ± 25 ±30 ±50 7.5.5定量 以基质匹配混合标准系列溶液的浓度为横坐标、色谱峰面积（响应值)为纵坐标，绘制标准曲线，标准 曲线的相关系数应不低于0.98。试样溶液与标准溶液中待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。 如超出线性范围，应重新试验或将试样溶液和基质匹配混合标准系列溶液做相应稀释后重新测定。单点 校准定量时，试样溶液中待测物的浓度与基质匹配混合标准溶液的浓度相差不超过30%。 标准加入法则以添加的标准溶液浓度为横坐标、色谱峰面积（响应值)为纵坐标，绘制标准曲线，并外 推至浓度坐标轴。 3 NY/T3803—2020 7.6试验数据处理 试样中霉菌毒素i的含量以质量分数w；计，单位为毫克每千克（mg/kg）。多点校准按式(1)计算，单 点校准按式（2)计算，标准加入法按式（3）计算。 p;XV (1) m X1000 式中： O; 从基质匹配混合标准曲线查得的试样溶液霉菌毒素i的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）； V. 提取溶液的体积，单位为毫升（mL）； m 试样质量，单位为克（g）。 A,Xpsi XV W;= (2) AXmX1000 式中： A; 试样溶液中霉菌毒素讠的色谱峰面积； Asi 基质匹配混合标准溶液中霉菌毒素i的峰面积； psi 基质匹配混合标准溶液霉菌毒素i的浓度，单位为纳克每毫升（ng/mL）。 Ax" w; (3) mX1000 式中： Poi 试样中霉菌毒素讠的浓度（即标准加入法标准曲线外推至横坐标上的截距），单位为纳克每毫 升(ng/mL)。 测定结果以平行测定的算术平均值表示，保留3位有效数字。 7.7 精密度 在重复条件下，获得的2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的20%。 NY/T3803—2020 附录A (规范性附录) 霉菌毒素分组、中文名称、英文名称、分子式、分子量、标准品纯度与检出限 本标准所测霉菌毒素分组、中文名称、英文名称、分子式、分子量、标准品纯度与检出限见表A.1。 表A.1 霉菌毒素分组、中文名称、英文名称、分子式、分子量、标准品纯度与检出限 纯度 检出限 分组 序号 中文名称 英文名称 分子式 分子量 CAS号 % μg/kg 黄曲霉毒素B Aflatoxin B Ci7 Hiz Os 312.3 1162-65-8 66 2 黄曲霉毒素B2 Aflatoxin B C Hi, Os 314.3 7220-81-7 66 A 3 黄曲霉毒素G Aflatoxin G C17 H