ICS67.050 X 04 NY 中华人民共和国农业行业标准 NY/T 3799—2020 生乳及其制品中碱性磷酸酶活性的测定 发光法 Determination of alkalinephosphatase activityin rawmilk and milk products- Enzymaticphoto-activated system method 「ISO22160:2007/IDF209:2007Milkandmilk-baseddrinksDetermination of alkaline phosphatase activityEnzymatic photo-activated system(EPAS) method,NEQJ 2020-11-12 发布 2021-04-01实施 中华人民共和国农业农村部 发布 NY/T 3799—2020 品标 煎农业 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草 本标准使用重新起草法参考ISO22160:2007/IDF209:2007《乳和乳饮料-碱性磷酸酶活性测定-酶光 活化（EPAS)方法》编制，与该ISO22160:2007/IDF209:2007的一致性程度为非等效。 本标准由农业农村部畜牧兽医局提出。 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274)归口。 （北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。 本标准主要起草人：李松励、文芳、郑楠、王加启、张吴、屈雪寅、张养东、赵圣国、祝杰妹、叶巧燕、 乔勤勤。 NY/T3799—2020 生乳及其制品中碱性磷酸酶活性的测定 发光法 1范围 本标准规定了生乳及其制品中碱性磷酸酶活性测定的发光法 本标准适用于牛、羊、水牛、耗牛等不同奶畜生乳及其制品（巴氏杀菌乳、调制乳、奶油等)中碱性磷酸 酶的测定。 本标准的检出限为20mU/L， 量限为60mU/l 2规范性引用文件 下列文件对于本文 的应 仅注日期的版本适用于本文件。 凡是不注日期的引用 GB/T6682 析实 3术语和定义 适用 下列术语和 3. 1 L 碱性磷酸酶活 ATk aline phosphatase achiyity 在本标准规 的聚件 定芳香 酸酶的量。 4原理 底物在碱性碳 酸酶的 光能亚 光信号，通过 大分子增强组分 信 量化学发光产 物的量，并转化成酶 RI 5 试剂或材料 除非另有规定， 5.1水，GB/T6682， 5.2底物（0.2mol/L） -螺旋金刚 苯基)-1 氧杂环丁烷二钠盐，溶于 含1%荧光素的DEAE缓冲液 底物应避光价 温度为4℃ 效期为6个月；若保存温度为 30℃，有效期为24h。使用时，应将其保持在0℃～7℃或置于冰上 5.3终止液：称取1.337g2-氨基-2-甲基1丙内醇， 睿解并定容至100mL。称取0.02g苯扎氯铵，用 水溶解并定容至100mL。上述两种溶液各取50mL，混勾，调节pH至10.7，作为底物酶水解反应的终止 液。若保存温度为4℃，有效期为1年；若保存温度为室温（18℃～24℃），有效期为2个月。使用前恢复 至室温。 温后，定容至100mL。 5.5碱性磷酸酶校准片：由已知碱性磷酸酶含量的干燥生乳制成的片剂，碱性磷酸酶活性为（875土26)μU。 使用前，用不含碱性磷酸酶的液体乳复原。在4℃下保存，有效期为2年。 1）可直接使用市售商品化底物试剂[例如CharmAP液体]。CharmAp液体是商品名，此处列出品牌仅提供参考，并不涉及商 业目的。给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用 这些等效的产品。 1 NY/T3799—2020 5.6巴氏杀菌乳校准液：取3支50mL试管分别标记为A,、B和C，在每个试管中用100μL水溶解一 个校准片。分别向管A，中加入20mL、管B中加入5mL、管C，中加入2.5mL无磷酸酶活性的巴氏杀菌 乳样品，使校准液Al、B和C的酶活性分别为44mU/L、175mU/L和350mU/L。盖上盖子，剧烈振荡 后，于冷藏条件下放置10min。使用前混勾。 5.7稀奶油或调制乳校准液：取3支50mL试管分别标记为A²、Bz和C2，在每个试管中用100μL水溶 解一个校准片。分别向管A2中加人10mL、管B中加人5mL、管C2中加入2.5mL无磷酸酶活性的稀奶 油或调制乳，使校准液A2、Bz和Cz中酶活性分别为88mU/L、175mU/L和350mU/L。盖上盖子，剧烈 振荡后，于冷藏条件下放置10min。使用前混勾。 5.8阳性质控：使用碱性磷酸酶冻干粉制备阳性质控。用10mL不含磷酸酶活性的代表性乳制品或阴 性试样复原，静置10min，制得含450mU/L碱性磷酸酶的阳性质控。若保存温度为0℃～7℃，有效期为 48h；若保存温度为一15℃以下，有效期为2个月。使用前恢复至室温，剧烈振荡。不宜反复冻融。 6仪器设备 6.1化学发光检测仪：540nm，配温度探针，通过内置软件将线性输出信号直接转换为酶活性，或带化学 发光检测功能的酶标仪。 6.2天平：感量为1mg、0.1mg。 6.3移液器：100μL、1mL、5mL。 6.4孵育器：（35±1)℃、（63±0.2)℃。 6.5水浴锅：(63土0.2)℃、(95±2)℃。 6.696孔酶标板：白色、不透明。 7样品 7.1试样制备 7.1.1生乳 生乳样品冷藏或冷冻保存。测定前，室温水浴解冻并混匀后，移取1mL生乳（或适量的稀释后活性 小于7000mU/L)试样加人到100mL容量瓶中，用阴性试样定容至刻度，混匀。 7.1.2巴氏杀菌乳 巴氏杀菌乳样品冷藏，混勾待测。 7.1.3调制乳或稀奶油 调制乳或稀奶油根据包装要求保存，混勾。 7.1.4阴性试样 取适量试样在95℃水浴加热保持1min，然后快速冷却。对于在95℃下保持1min可能发生沉淀和 分离的乳制品，可适当降低温度并延长时间，如羊乳，可63℃保持30min。阴性试样若保存温度为0℃～ 7℃，有效期为48h；若保存温度为一15℃以下，有效期为6个月。使用前恢复至室温，剧烈振荡。不宜反 复冻融。 8试验步骤 8.1带直接测定酶活性结果的内置软件的化学发光检测仪的校准 8.1.1应对每类乳制品分别进行校准，建立各种待测类型产品的校准曲线。当重新配制底物和终止液 时，需重新进行校准。 8.1.2设定发光检测仪，默认背景值为100，校准值为100。 8.1.3用阴性试样校准：移取100μL底物至一次性带盖小管，再加入100μL阴性试样，混匀，置于35℃ 的孵育器中孵育3min。在孵育结束后的15s内加1.0mL终止液。从孵育器中取出小管，剧烈振荡 2 NY/T3799—2020 5s。将小管插入发光检测仪，读取并记录检测仪的读数。试验重复3次，计算阴性平均值（N），若任何一 个值与平均值的相对偏差超过30%，则按8.1.3重新测定。 8.1.4用350mU/L校准液校准：移取100μL底物加人一次性带盖小管，再加入100μL校准品C或 C2，混匀，置于35℃的孵育器中孵育3min。在孵育结束后的15s内加入1.0mL终止液。从孵育器中取 出小管，剧烈振荡5S。将小管插入发光检测仪，读取并记录检测仪的读数。试验重复3次，计算平均校准 值（C），若任何一个值与平均值的相对偏差超过30%，则按8.1.4重新测定。 8.1.5使用平均校准值C，和阴性平均值N，按式(1)计算校正值C,，按式(2)计算背景值B。参阅光度 检测仪手册将校正值C，输入检测仪中，建立新的校正值，背景值B。输入光度计成为新的背景值。 C,=(Cr-N)X0.286.... (1) B,=[N/(C,/100)]+100 (2) 8.1.6再次用阴性试样校准：重复8.1.3的操作。验证巴氏杀菌乳阴性试样的碱性磷酸酶活性是否小于 5mU/L，调制乳和奶油阴性试样的碱性磷酸酶活性是否小于15mU/L。若平均值超出范围，从8.1.3开 始重新测定 8.1.7再次用350mU/L校准液校准：重复8.1.4的操作。验证校准品平均值是否在320mU/L~ 400mU/L范围内。若任何一个值与平均值的相对偏差超过30%，从8.1.4开始重新测定。 8.1.8用44mU/L或88mU/L校准液校准：参照8.1.4的操作，将加入100μL校准品C或C更改为 加人100μL校准品A，或A2，其余操作步骤同8.1.4。验证44mU/L的校准液平均值是否在32mU/L~ 55mU/L，或88mU/L校准品平均值是否在45mU/L～110mU/L范围内。若任何一个值与平均值的 相对偏差超过40%，则按8.1.8重新测定。 8.1.9用175mU/L校准液校准：参照8.1.4的操作，将加入100μL校准液C或C,更改为加人100μL 校准品B或B2。验证175mU/L校准品平均值是否在145mU/L～205mU/L范围内。若任何一个值 与平均值的相对偏差超过30%，则按8.1.9重新测定。 8.1.10阴性质控检测：按测定程序8.1.3进行，不加待测样品。每天进行阴性质控测试，以验证光度检测 仪校准和试剂性能。在适当校准的通道，若测得的碱性磷酸酶活性水平低于5mU/L，则系统通过验证。 8.1.11阳性质控检测：用阳性质控样品，参照8.1.4的操作，将加人100μL校准品C或C更改为加入 100μL阳性质控样品（5.8）。每天进行阳性质控检测，以验证光度计校准和试剂性能。阳性质控样品测 定值应为300mU/L～585mU/L。若在此范围内，表明校准完成，可进行样品测定